EVALUACIÓN IN VITRO DE COMPUESTOS BORADOS DERIVADOS CARBABORATINIB PARA EL TRATAMIENTO DEL GLIOMA MULTIFORME POR BNCT

DAVILA B; NIEVAS S; CARPANO M,; THORP S; CUROTTO P; POZZI E; CASAL M; SIRE COUTO M.; CERECETTO H.; DAGROSA MA

Buenos Aires

Congreso; XLVI Reunión anual de la Asociación Argentina de Tecnología Nuclear; 2022

Asociación Argentina de Tecnologia Nuclear

Los glioblastomas (GB) son los tumores de mayor agresividad dentro del sistema nervioso central en adultos. El pronóstico de vida de quien lo padece no va más allá de los 14 meses y los tratamientos que existen no son muy efectivos. Es por ello que la terapia bimodal: terapia dirigida + terapia por captura neutrónica en boro (BNCT), actuando por un lado sobre los mecanismos de proliferación celular y por el otro generando daño celular, podría ser una alternativa para el tratamiento de estos tumores. Los compuestos propuestos para la combinación de terapias son derivados del fármaco líder erlotinib (aprobado por la FDA para el tratamiento del cáncer) y son candidatos a BNCT por contener una estructura de carborano cargada con boro. Su evaluación como inhibidores de tirosina quinasas, ha sido demostrada en estudios previos.En el marco de una colaboración realizada entre el grupo de Química Orgánica Medicinal (Uruguay) y nuestro grupo de BNCT en la División de Bioquímica nuclear (CNEA Argentina) se realizaron estudios in vitro con la finalidad de evaluar el potencial de estos fármacos como carriers de boro en la aplicación de BNCT para el tratamiento del glioblastoma. Los objetivos específicos de este trabajo fueron:1)Evaluar la incorporación celular de los compuestos borados derivados de erlotinin (C0, C2, C4)2)Analizar la efectividad biológica relativa de cada uno de los compuestos evaluados.3)Estudiar los mecanismos de daño inducido por la radiación- Procedimientos:Para estos estudios se utilizaron dos líneas celulares de GB humano (U87MG) y de rata (F98), y un cultivo primario de astrocitos de rata. Las células fueron cultivadas en medio DMEM suplementado con suero fetal bovino (10%) mantenidas a 37 ºC en una atmósfera húmeda conteniendo 5% CO2. Captación intracelular de Boro: las células fueron sembradas en placas de 60 cm. A las 24h estando 70% confluentes fueron incubadas con cada uno de los compuestos a una concentración final de 46 uM durante 1, 4 o 24 h. Las células fueron lavadas y digeridas con ácido Fórmico. Una alícuota se usó para la determinación de proteínas por el método de Lowry y otra para la medición de boro por ICP-AES.Ensayo de BNCT: 3000 células/ pocillo fueron sembradas en placas p96. A las 24h las células fueron incubadas durante 1 h con 1 ppm de 10B de cada uno de los derivados de erlotinib (C0, C2, C4) y de borofenilalanina (BPA). Posteriormente, las células fueron irradiadas en el RA3 (flujo neutrónico 1 1010 n/cm2.seg) a las dosis físicas totales de 1, 3 y 5 Gy. Por otro lado, se irradiaron células sembradas en las mismas condiciones con el haz de neutrones solamente y con radiación gamma 60Co (3Gy/min). A los 5 días post irradiación se determinó el porcentaje de células viables por el ensayo de MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide.Ensayo de proliferación: células en placas de 60cm con fondo de vidrio y 70% de confluencia, fueron luego irradiadas a una dosis física total de 3 Gy. Veinticuatro horas post irradiación se realizó la inmunicitoquimica utilizando el anticuerpo monoclonal Ki67 murino.Mecanismo de muerte celular: placas de 60cm fueron sembradas con 3000 células hasta un 70% de confluencia. A las 48 h post irradiación (3Gy) las células fueron lavadas, tripsinisadas e incubadas con el mix de colorantes Hoesch, ioduro de propidio (IP), difluoroceina (DAF). Se analizó cuantitativamente apoptosis, necrosis y viabilidad celular en observaciones por microscopio de fluorescencia. -Resultados: Los tres compuestos (C0, C2 y C4) lograron ser captados selectivamente por U87MG respecto de los astrocitos, sin embargo, en F98 la selectividad solo fue observada para los compuestos C2 y C4. A las 4 h de incubación, las relaciones en la captación de boro (célula tumoral/célula normal) para C0, C2 y C4 fueron respectivamente de:54, 15 y 28 para U87MG y de 11 y16 para F98. Además, se observó una mayor relación en la captación de los tres compuestos respecto al BPA en U87MG con valores de entre 7 y 27 (C4>C2>C0>BPA). En F98 solo C2 y C4 mostraron una mayor captación que el BPA con valores de relación de 19 y 21 (C2>C4>BPA>C0). En los experimentos de irradiación las curvas dosis respuesta realizadas mostraron que con todos los tratamientos (BNCT, Neutrones, Gamma) la sobrevida disminuyo a medida que la dosis física absorbida aumentaba. Se observó que la efectividad de BNCT usando los tres derivados de erlotinib fue mayor que para BNCT usando BPA, el haz de neutrones sin boro y que la radiación gamma. Los estudios de inmunocitoquimica mostraron una menor proliferación celular 24 h post irradiación para el C0 en relación a C2 y C4. El análisis celular por microscopia de fluorescencia revelo que el mecanismo principal de muerte inducido por la suma de ambas terapias en el caso de los tres compuestos seria la necrosis. Conclusiones: Dos de los tres compuestos derivados de erlotinib (C2 y C4) mostraron mejores resultados y podrían ser utilizados en terapia combinadas como portadores de boro para la aplicación de BNCT en el tratamiento de glioblastoma.