Mecanismo de endocitosis de transportadores canaliculares en la colestasis por estradiol 17ß-D-glucurónido. Estudios en duplas aisladas de hepatocitos de rata

MISZCZUK, GISEL SABRINA; BOAGLIO, ANDREA C; BAROSSO, ISMAEL R.; LAROCCA, M CECILIA; SÁNCHEZ POZZI, ENRIQUE J; ROMA, MARCELO G; CROCENZI, FERNANDO A.

Buenos Aires

Congreso; XVIII Congreso Argentino de Hepatología; 2015

Entre las colestasis de tipo adquirida, se destaca la colestasis del embarazo, habiéndose implicado en su patogénesis al metabolito estrogénico endógeno estradiol 17ß-D-glucurónido (E17G). Previamente, demostramos que los transportadores canaliculares Bsep y Mrp2, esenciales para la formación de bilis, sufren internalización endocítica en diferentes modelos de colestasis, siendo este fenómeno responsable de la falla secretora biliar en la colestasis inducida por E17G.Se desconoce el mecanismo por el cual E17Ginduce dicha endocitosis, siendo su elucidación el objetivo de este trabajo. Métodos: Se obtuvieron DAHR mediante doble perfusión de hígados de rata con colagenasa, se enriquecieronpor elutriación, se cultivaron 4,5 hs. en placas con colágeno (37ºC, 2x104 cél/mL) en medio L15 y, finalmente, se expusieron a E17G 200 µM durante 20 min, o a su vehículo (DMSO; grupo control). Se realizaron pre-tratamientos de 15 min para inhibir la endocitosis dependiente de clatrina con i) monodansil-cadaverina (MDC) 100 µM o ii) depleción de K+ (-K+), así como la endocitosis dependiente de caveolina con filipina (F) 1µg/mL. La actividad de Bsep y Mrp2 se evaluó mediante el análisis de imágenes obtenidas por microscopía de fluorescencia luego de incubar las DAHR durante 15 min con 0,3 µM CGamF (sustrato fluorescente de Bsep) o con 2,5 µM CMFDA (precursor de GS-MF, sustrato fluorescente de Mrp2). Así, se determinó el % de DAHR (> 200) que exhibieron acumulación vacuolar canalicular (AVc) de los sustratos fluorescentes. Por inmunofluorescencia seguida de microscopía confocal se evaluó el efecto de MDC y F sobre la localización intracelular de Bsep y Mrp2, así como el efecto de E17G en la colocalización de Mrp2 con estructuras involucradas en la endocitosis dependiente de clatrina, como clatrina y AP2. Resultados: El E17G disminuyó la AVc de CGamF (45,8±7,5%) y GS-MF (48,7±8,6%) respecto del control (100%), p