Desarrollo de una metodologia basada en PCR en tiempo real para la determinacion del gen RHD.

BERNACCHIA A; TRUCCO BOGGIONE C; BIONDI C; COTORRUELO C

Rosario

Jornada; XI Jornadas de Ciencia y Tecnología; 2017

Secretaría de Ciencia y Tecnología de la Universidad Nacional de Rosario

El estudio del antígeno D del sistema Rh es de gran importancia en Obstetricia y Medicina Transfusional debido a su elevada inmunogenicidad y a su rol en la patogénesis de la Enfermedad Hemolítica Fetoneonatal (EHFN), en algunas Anemias Hemolíticas Autoinmunes y en Reacciones Hemolíticas Transfusionales. Luego del descubrimiento de ADN fetal libre en el plasma de mujeres embarazadas, se han desarrollado diferentes estrategias no invasivas para el diagnóstico de enfermedades y/o alteraciones genéticas fetales que permiten el abordaje temprano de la patología detectada. En nuestro laboratorio realizamos la genotipificación RHD prenatal no invasiva para el diagnóstico de la EHFN utilizando equipos comerciales. El objetivo de este trabajo es desarrollar una metodología in-house de bajo costo basada en PCR en tiempo real para detectar el gen RHD. Se seleccionaron cebadores alelo específicos para amplificar regiones genómicas de los exones 7 y 10 del gen RHD y se utilizaron sondas de hidrólisis NFQ-MGB marcadas con FAM para detectar ambos exones. Las concentraciones finales de los cebadores fueron 0,3 µM y de las sondas utilizadas fueron 0,2 µM. Las reacciones se realizaron en un buffer compuesto por MgCl2 (1,5 mM), KCl (10 mM), Tris-HCl (2 mM, pH=9 a 25ºC), dNTPs (0,2 mM), Triton X-100 (0,02%) y Taq ADN polimerasa (1 unidad). El volumen de reacción fue de 20 µL y el programa de amplificación consistió en un ciclo inicial de 4 minutos a 95ºC, seguido por 40 ciclos de 15 segundos a 95ºC y 1 minuto a 60ºC. Las reacciones se llevaron a cabo en el equipo StepOne de Applied Biosystem. Para evaluar la performance del ensayo en las condiciones experimentales elegidas se realizaron curvas de calibración a partir de los datos obtenidos de reacciones monoplex utilizando un ADN genómico de referencia (K562) de concentración conocida (10 ng/µL), diluido de manera seriada abarcando un amplio espectro de concentraciones y procesado por triplicado. Se evaluaron cuatro concentraciones diferentes de ADN: 3,2 ng/µL, 0,32 ng/µL, 0,032 ng/µL y 0,0064 ng/µL. Para cada reacción se determinó el ciclo umbral (Ct) y a partir de los valores de Ct promedio correspondiente a cada concentración se realizaron las curvas de calibración para ambos exones graficando el Ct en función del logaritmo de la concentración de ADN. A partir de la curva de calibración se calcularon los parámetros de eficiencia (E) mediante la ecuación E= [(10-1/m -1)*100] siendo m la pendiente de la curva de calibración y linealidad (L) estimado por el cuadrado del coeficiente de correlación de Pearson (R2). Se obtuvo una alta eficiencia para el exón 10 (E=108%) y una baja eficiencia para el exón 7 (E=82 %). Las reacciones de amplificación para ambos exones mostraron un comportamiento lineal en las concentraciones ensayadas (R2 = 0,998 para el exón 10 y R2 = 0,991 para el exón 7). Los resultados obtenidos indican que la determinación del exón 10 en las condiciones ensayadas resulta óptima para detectar el extremo 3? del gen RHD. Por otro lado, teniendo en cuenta la baja E del ensayo para detectar el exón 7 se propone evaluar nuevas condiciones de reacción que permitan aumentar su rendimiento. Considerando que las normas internacionales establecen que para evitar resultados incorrectos es necesario la detección simultánea de dos regiones diferentes del gen RHD, estudiaremos además otras regiones centrales del gen RHD.