Determinación de inmunoglobulina G en eritrocitos senescentes por citometría de flujo

ENSINCK A; RUCCI A; COTORRUELO C; RACCA L; RACCA A

Buenos Aires

Congreso; VII Congreso. Grupo Iberoamericano de Medicina Transfusional. XIII Congreso Argentino; 2011

Asociación Argentina de Hemoterapia e Inmunohematología

Fundamento: Después de 120 días, los glóbulos rojos (GR) son eliminados de la circulación por los macrófagos. El análisis de los procesos que ocurren durante el envejecimiento están limitados por la dificultad de obtener fracciones homogéneas que contienen GR de la misma edad. Investigaciones recientes sostienen que la unión de IgG autóloga a un neoantígeno asociado a la proteína banda 3 de la membrana eritrocitaria, sería determinante en la remoción de los GR senescentes (Se). Objetivos: Analizar en sangre entera la presencia de IgG unida in vivo en poblaciones de GRSe y GR jóvenes (J) por citometría de flujo. Materiales y Métodos: Se trabajó con muestras de sangre periférica provenientes de dadores voluntarios sin patología demostrable, que concurrieron al Servicio de Hemoterapia del Hospital Provincial del Centenario de Rosario (n=11). Las muestras fueron evaluadas por citometría de flujo utilizando para identificar las poblaciones de GRSe y GRJ, parámetros de dispersión de luz: Foward Scatter (FSC) y Side Scatter (SSC). Las suspensiones eritrocitorias fueron incubadas con anti-IgG humana marcada con Alexa 488, durante 60 minutos a temperatura ambiente en oscuridad. Posteriormente estas poblaciones celulares se examinaron en el citómetro FACSAria II utilizando los programas FACSDiva y Paint a gate para adquisición y análisis. Se utilizaron GR O RhD positivos sensibilizados con un anticuerpo anti-D de clase IgG obtenido en nuestro laboratorio, como control positivo. Las poblaciones de GR fueron seleccionadas en plots FSC/SSC en escala logarítmica. Los parámetros ensayados fueron evaluados en histogramas y dot-plot (FL1 vs FSC). Resultados: En el análisis de los dot-plot basados en FSC (tamaño celular) versus SSC (densidad celular) se identificaron dos poblaciones de GR de diferente tamaño y densidad. La unión de IgG a la membrane eritrocitaria fue evaluada mediante la intensidad de fluorescencia media (MIF) GRSe: 748+/-108 y GRJ: 47+/-15. Los porcentajes de células positivas para IgG fueron: GRSe: 1.5% y GRJ: 0.16 %. Conclusiones: Estos hallazgos indican que la citometría de flujo permite evaluar poblaciones eritrocitarias de distintas edades, sin realizar una separación física de las células. La estimación de IgG sobre la membrana eritrocitaria por esta metodología, permite utilizar pequeñas cantidades de muestras y evita la manipulación de las técnicas separativas.