Estrategia molecular para la genotipificación RHD fetal en plasma materno

COTORRUELO C; LUJÁN BRAJOVICH M; BIONDI C; GARCÍA BORRÁS S; DI MÓNACO R; RACCA A

La Falda - Córdoba

Congreso; LVI Reunión Científica de la Sociedad Argentina de Inmunología,; 2008

Sociedad Argentina de Inmunología

La detección prenatal del antígeno D del sistema Rh es de utilidad cuando el feto está en riesgo de anemia hemolítica debido a una aloinmunización materna. En trabajos anteriores hemos realizado la genotipificación RHD fetal en muestras de ADN obtenidas de células de líquido amniótico por amniocentesis. Sin embargo este procedimiento invasivo presenta riesgos para la continuidad del embarazo. Recientemente se ha demostrado que durante la gestación, aproximadamente 3% del ADN libre en plasma materno es de origen fetal. El objetivo de este trabajo fue desarrollar una estrategia de genotipificación RHD prenatal, basada en PCR convencional, utilizando ADN obtenido de plasma materno. Se estudiaron 17 muestras de sangre periférica de mujeres RhD negativas con embarazo único (rango de gestación 25 a 33 semanas), que concurrieron al Servicio de Obstetricia del Hospital Provincial del Centenario. El ADN fue extraído de 400 μL de plasma materno por adsorción en membranas de sílica gel y posterior elución. El genotipo RHD fetal fue determinado con estrategias de nested PCR en un único tubo. Se realizaron reacciones con cebadores para amplificar el intrón 4 y la región 3? no codificante del gen RHD. Al cabo de 25 ciclos se agregaron cebadores internos al fragmento amplificado y se continuó la reacción 20 ciclos más. Paralelamente se amplificó con una misma estrategia, el gen SRY para confirmar el origen fetal del ADN obtenido. Los productos obtenidos fueron analizados en geles de agarosa al 2% teñidos con bromuro de etidio. Posteriormente se determinó el fenotipo RhD en sangre de cordón de los recién nacidos por hemaglutinación. Se genotipificaron 12 fetos RHD positivos y 5 fetos RHD negativos. Se determinó la presencia del gen SRY en 6 fetos RHD positivos y en 3 fetos RHD negativos. En 2 de las muestras analizadas no se obtuvieron productos de amplificación en ninguna de las reacciones realizadas. Los resultados fueron coincidentes con el fenotipo RhD y el sexo del recién nacido. Estos hallazgos indican que la estrategia de nested PCR permite realizar la genotipificación RHD a partir de ADN obtenido del plasma de mujeres embarazadas. Cuando todos los estudios moleculares fueron negativos no se pudo confirmar la presencia de ADN fetal. La determinación prenatal no invasiva del gen RHD evitaría cuando el feto es RhD negativo, el uso de la profilaxis con IgG anti-D durante el embarazo.