CAMBIOS CONFORMACIONALES EN LA PROTEÍNA BANDA 3 DE LA MEMBRANA ERITROCITARIA ASOCIADOS AL ENVEJECIMIENTO

PLATERO E; ENSINCK A; RUZZINI M; RACCA L; COTORRUELO C; RACCA A; RUCCI A

Casilda

Congreso; XIV Congreso y XXXII Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario; 2012

Sociedad de Biología de Rosario

La proteína banda 3 de la membrana eritrocitaria es una proteína de 911 aminoácidos, con 14 motivos transmembrana. Estas estructuras tienen secuencias muy conservadas y corresponden a la familia de proteínas intercambiadoras de aniones AE (Anion Exchangers). 4,4-diisothiocyanatostilbene-2,2′-disulfonate (DIDS) es un inhibidor competitivo del intercambio Clˉ/HCO3ˉ de AE1, se uniría a lisina 539 o 542, del 5º motivo transmembrana y puede utilizarse para evaluar cambios conformacionales. Banda 3 es la proteína mayoritaria de la membrana de los glóbulos rojos (GR) y podría participar en la generación del antígeno de senescencia eritrocitaria (ASE), responsable de la remoción selectiva de los GR senescentes (GRSe). El objetivo de este trabajo fue evaluar los cambios conformacionales de la proteína banda 3 a través de las modificaciones de los espectros del aducto DIDS-banda 3 en poblaciones de GR jóvenes (GRJ) y GRSe. Se estudiaron 8 muestras de sangre periférica con serología negativa de dadores voluntarios que concurrieron al servicio de Hemoterapia del Hospital Provincial del Centenario. Se centrifugaron 10 mL de cada muestra anticoagulada con EDTA a 1000 g para separar el plasma, y el paquete globular se lavo 3 veces con solución fisiológica (SF). Las poblaciones de GRJ y GRSe se obtuvieron sometiendo las muestras a gradientes preformados de Percoll, verificando la eficiencia de la separación por el volumen corpuscular medio (VCM). Las distintas muestras se incubaron durante 45 min a 37 ºC en una solución de DIDS 25 µM en PBS. Se realizaron tres lavados. Se lisaron con buffer fosfato 5 mM pH 8 (5P8), los pellets obtenidos se lavaron 2 veces. Se disolvieron al 25 % en una solución del detergente octaethylene glycol monododecyl ether (C12E8) al 1 %. Se realizó la medición en espectrofotómetro de fluorescencia Varian Cary Eclipse. Los espectros de excitación se obtuvieron entre 300 y 450 nm (λem= 460 nm). Los espectros de emisión entre 360 y 600 nm. (λexc= 350 nm). Los resultados se expresaron como la diferencia en nm del pico máximo del espectro de DIDS libre con respecto a cada población. En promedio los espectros de emisión del aducto de GRJ se movieron al rojo 49,52 ± 8,39 nm, mientras que en GRSe la variación fue de 47,67 ± 10,00 nm. Para los espectros de excitación, los cuales se corren al azul, los corrimientos fueron en GRJ 2,76 ± 0,71 nm y en GRSe 10,06 ± 5,07 nm. Los resultados obtenidos muestran cambios en la estructura terciaria de AE1 entre las poblaciones eritrocitarias de distintas edades. Estas modificaciones conformacionales del dominio de membrana de la proteína banda 3 podrían estar involucradas en la generación de ASE.