Estrategia de PCR en tiempo real para la determinación no invasiva del genotipo RHD fetal

DI MÓNACO R; GARCÍA BORRÁS S; BIONDI C; RACCA A; COTORRUELO C

Rosario

Congreso; XI Congreso y XXIX Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario; 2009

Sociedad de Biología de Rosario

Las mujeres embarazadas RhD negativas deben recibir una profilaxis con inmunoglobulina anti-D para evitar la formaci¨®n de aloanticuerpos, siendo incluidas en este tratamiento las gestantes cuyos fetos son RhD negativos. Recientemente se ha demostrado que durante la gestaci¨®n, aproximadamente 3% del ADN libre en plasma materno es de origen fetal. El objetivo de este trabajo fue desarrollar una estrategia de PCR en tiempo real para la determinaci¨®n no invasiva del genotipo RHD fetal a partir de una muestra de plasma materno. Se estudiaron 15 muestras de sangre perif¨¦rica de mujeres RhD negativas con embarazo ¨²nico (rango de gestaci¨®n 21 a 35 semanas), que concurrieron al Servicio de Obstetricia del Hospital Provincial del Centenario. El ADN fue extraido de 800 ¦ÌL de plasma materno por adsorción en membranas de sílica gel y posterior eluci¨®n. El genotipo RHD fetal fue determinado con una estrategia de PCR en tiempo real. Se utilizaron cebadores para amplificar una regi¨®n del ex¨®n 7 y una regi¨®n del ex¨®n 10 del gen RHD y sondas fluorog¨¦nicas marcadas con VIC (ex¨®n 7) y FAM (ex¨®n 10). Tambi¨¦n se amplific¨® un fragmento del gen SRY y se utiliz¨® para su detecci¨®n una sonda marcada con VIC, para confirmar el origen fetal del ADN obtenido. El ex¨®n 7 fue amplificado en un sistema de PCR monoplex mientras que se utiliz¨® una PCR duplex para estudiar el ex¨®n 10 y el gen SRY. Posteriormente se determin¨® el fenotipo RhD en sangre de cord¨®n de los reci¨¦n nacidos por hemaglutinaci¨®n. Se genotipificaron 11 muestras RHD positivas y 4 muestras RHD negativas. Se determin¨® la presencia del gen SRY en 7 muestras RHD positivas y en 2 muestras RHD negativas. Los resultados fueron coincidentes con el fenotipo RhD y el sexo del reci¨¦n nacido. Estos hallazgos indican que la estrategia de PCR en tiempo real desarrollada permite realizar la genotipificaci¨®n RHD a partir de ADN obtenido del plasma de mujeres embarazadas. Cuando todos los estudios moleculares fueron negativos no se pudo confirmar la presencia de ADN fetal. La genotipificaci¨®n RHD fetal no invasiva contribuir¨¢ a racionalizar el uso de la profilaxis con inmunoglobulina anti-D permitiendo su administraci¨®n exclusivamente a gestantes de fetos RhD positivos.