Eficacia de extracción de ARN total a partir de muestras de lavaje broncoalveolar en equinos

ZAPPA ME; PONZINIBBIO MV; VERDE C; CORBI BOTTO CM; SADABA SA; PERAL GARCIA P; LOPEZ RA; TRIGO P; DÍAZ S

Pucon

Congreso; XIX Congreso Chileno de Medicina Veterinaria; 2016

Escuela de Medicina Veterinaria de la Universidad Católica de Temuco

Introducción: En los lavajes broncoalveolares (LBA) de caballos pueden observarse una población celular heterogénea. Sin embargo no está bien determinado si la predominancia de una línea celular dada representa un proceso fisiopatológico diferente o varios estadios de una enfermedad. El objetivo de este trabajo fue validar un procedimiento para obtener ARN a partir de LBAs, permitiendo futuros estudios de expresión genética en LBA equinos.Material y métodos:Se realizó un LBA en 9 caballos con sonda flexible (Bivona inc 2.5m largo, 11mm diam ext, 7mm int). Se inyectaron y recogieron 6 jeringas con 50ml de solución fisiológica. El líquido resultante se recogió en jeringas estériles y refrigeradas durante todo el procedimiento. El contenido de cada jeringa se concentró por centrifugación a 2000 rpm, se descartó el sobrenadante, y el material celular resultante se resuspendió en solución fisiológica en un único tubo, resultando en un pellet celular de tamaño variable, que se fracciono en tres alícuotas para realizar: a) Tinción celular diferencial con coloración de May Grunwald para poner en evidencia la morfología celular; b) recuento de células presentes por unidad de volumen; c) extracción de ARN con Trizol® según las recomendaciones del fabricante. El ARN resultante se cuantifico por espectrofotometría y la masa obtenida se expresó como concentración (ng/ul), y la calidad e integridad de la molécula se visualizó por electroforesis en gel de agarosa 1%, TBE1X con ADNg como control.Resultados y discusión: El rendimiento de ARN vario entre 5.47μg (3.500.000 células/ml) a 40μg (37.200.000 células/ml) de alta calidad (260/280=1.7/1.9). Los resultados obtenidos permitieron conocer la cantidad y tipos celulares presentes en el LBA en distintas situaciones fisiológicas del caballo, comparar con valores de referencia, y evaluar la eficacia del procedimiento de extracción de ARN en función de la cantidad de material genético obtenido a partir de la muestra de LBA.Conclusión: La técnica descripta permitió la extracción de ARN de muestras de de LBA en todos los animales muestreados. Este ARN podría ser utilizado para cuantificar la expresión de genes específicos que podrían permitir una lectura mas clara del proceso patológico.