CYTOCROMO P450 REDUCTASAS EN TRYPANOSOMA CRUZI. CLONADO Y CARACTERIZACIÓN

VILLAMIL SF; PORTAL P; ALONSO GD; FLAWIA MM; TORRES HN; PAVETO C

Mendoza, Argentina.

Congreso; VII Congreso Argentino de Protozoologia y Enfermedades Parasitarias.; 2005

Sociedad Argentina de Protozoologia.

El metabolismo de oxido-reducción dependiente de citocromo P450 es llevado a cabo por una familia de flavoproteínas dependientes de NADPH  distribuídas en un amplio rango de organismos, desde bacterias hasta vertebrados. Estas enzimas catalizan procesos de producción y conversión de especies reactivas de oxígeno, participando así de procesos de detoxificación, síntesis de lípidos,  mecanismos inflamatorios de respuesta a infecciones, etc. La purificación parcial y caracterización de una actividad de Cyt P450 reductasa había sido previamente reportada en el parásito. En trabajos previos hemos caracterizado bioquímicamente una sintasa de óxido nítrico soluble (NOS) en Trypanosoma cruzi, que es también una enzima dependiente de NADPH con sitio de unión para FAD, FMN, BH4, y un dominio de Cyt P450 reductasa. Aquí presentamos las secuencias codificantes para varias Cyt P450 reductasas, dos de las cuales han sido clonadas y expresadas en E. coli usando el vector de expresión pRSET-A. El análisis teórico de estas dos secuencias, denominadas TcR-639 y TcR-819, mostró 22 % de identidad en aminoácidos, son homologas y poseen alta identidad  con otras reductasas y NOS. Corresponden a genes de copia única y el análisis por Northern blot, y RT-PCR detecta la presencia de los respectivos mensajeros en epimastigotes de T.cruzi. Las recombinantes purificadas se caracterizaron  bioquímicamente. Se obtuvo una Km para NADPH de 50 uM para el TcR- 639 y  de 17 uM para el TcR-819. No utilizan NADH como cofactor para su actividad reductora del Cyt C .Se demostro su  capacidad para  reducir in vitro a sustratos alternativos y de participar  en  procesos de deaminación y deetilación dependientes de Cyt P450 medido en un sistema heterólogo in vitro. Ambas enzimas recombinantes fueron inhibidas parcialmente por DPIC.