Rol de los cambios ultraestucturales y el tráfico de calcio a la mitocondria en la apoptosis de corazones pre-diabéticos

FEDERICO M,; LÓPEZ, S.; PORTIANSKY E; ZAVALA, M; VILLA ABRILLE MC; MATTIAZZI A; PALOMEQUE J

Mar del Plata

Congreso; XXVI Congreso SAHA; 2019

SAHA

Introducción: En resultados previos hemos demostrado que los cardiomiocitos de corazones pre-diabéticos presentan una alteración en el manejo de Ca+2 un aumento en las especies reactivas del oxígeno, un aumento de la actividad de la calcio-calmodulina kinasa II (CaMKII), junto con una disfunción mitocondrial y una disminución en la distancia mitocondria-retículo sarcomplasmático (RS), lo que se asocia con apoptosis celular.El manejo de Ca+2 en el cardiomiocito es fundamental para una correcta contracción y funcionamiento del mismo, por lo que pequeños desequilibrios pueden ocasionar arritmias, apoptosis y disfunción contráctil, entre otras alteraciones. Por esto, la salida de Ca+2 por el RS a través de los receptores de rianodina (RyR2), que cumple un rol fundamental en la liberación de Ca+2 inducida por Ca+2 del acoplamiento excito-contráctil, se encuentra finamente modulada. Si la función del RyR2 está alterada puede generarse una salida exagerada de Ca+2 del RS en diástole que indefectiblemente ocasionará efectos deletéreos. En resultados previos mostramos que en corazones de ratones pre-diabéticos la pérdida de Ca+2 a través de los RyR2 por fosforilacion mediada por CaMKII, genera apoptosis y arritmias, lo que podría impactar de manera radical en el tráfico de Ca+2 entre el RS y la mitocondria, y posteriores alteraciones en el tejido cardiaco.La comunicación RS-mitocondria cumple un rol fundamental en situaciones fisiológicas y patológicas. La concentración de Ca+2 intramitocondrial depende, en parte, del Ca+2 que existe en el microdominio entre ambas organelas. Pequeños cambios en la [Ca+2] en estos microdominios pueden producir grandes alteraciones, ya que por un lado el Ca+2 es necesario para la producción de ATP, pero superado un umbral, resulta deletéreo. La asociación RS-mitocondria está modulada, en cierta medida, por proteínas que participan tanto en los movimientos de Ca+2 a través de las organelas (canal aniónico dependiente de voltaje [VDAC]), como en el anclaje de ambas organelas entre sí (mitofusina [Mfn-2] y proteína regulada por glucosa 75 [GRP75]).Nuestra hipótesis es que cambios en la expresión de Mfn-2, GRP75 y VDAC y alteraciones ultra estructurales dependiente de CaMKII en corazones de ratones pre-diabéticos, alteran la regulación de la comunicación RS-mitocondria y favorecen un tráfico de Ca+2 exacerbado entre ambas organelas, sobrecargando de Ca+2 a la mitocondria y desencadenando apoptosis.Objetivos:a) Evaluar en corazones y/o cardiomiocitos de ratones pre-diabeticos:1- la pérdida de Ca+2 por los receptores de RyR2.2- la actividad del RyR2.3- la expresión de las proteínas Mfn-2, GRP75 y VDAC.4- la capacidad buffer de Ca+2 de las mitocondrias.5- la ultra estructura celular.b) Explorar el rol de la CaMKII en los cambios en el manejo de Ca+2, la ultraestructura y la expresión de proteínas en corazones y/o cardiomiocitos de ratones pre-diabeticos AC3I, que presentan constitutivamente un péptido inhibidor de la CaMKII.Materiales y métodos: Se utilizaron ratones C57 (wild type, WT), AC3I (que contienen un péptido inhibidor de CaMKII) y S2814D (que poseen el sitio fosforilable por CaMKII, S2814 del RyR2 mutado a Aspartato, generando una pseudofosforilación constitutiva por CaMKII). Los animales se alimentaron con una dieta control (DC) o una dieta rica en fructosa (DRF). Los corazones enteros se destinaron a ensayos de unión de rianodina tritiada ([3H] Ry), western blot, microscopia electrónica de transimisión (MET) y aislamiento de mitocondrias para medir la capacidad buffer mediante espectrofluorometría. Cardiomiocitos aislados enzimáticamente se utilizaron para evaluar el manejo de Ca+2 citosólico por microscopía confocal.Resultados:Los experimentos de microscopía confocal demostraron que se encuentra significativamente aumentada tanto la producción de chispas de Ca+2 (100±77.1 vs 1675±819.4), de ondas de Ca+2 asociadas a contracciones espontáneas (100±36.5 vs 360±80.8) y de las contracciones espontáneas (100±29.3 vs 312.5±43.0) en los cardiomiocitos de ratones WT DRF respecto de los ratones WT DC, indicando una pérdida diastólica de Ca+2 por el RS.Los ensayos de unión de [3H] Ry indicaron una actividad máxima significativamente mayor de los RyR2 de corazones de ratones WT DRF (Vmax = 47.9±5.3 ftmol/mg proteína) respecto de corazones de animales WT DC (Vmax =33.6±4.2) y AC3I DRF (32.2±5.9). Llamativamente, la Vmax de corazones de ratones S2814D DC (65.8±9.8) no difiere de los WT DRF, sugiriendo una fosforilación en los ratones WT DRF similar a la de los ratones S2814D DC.Por otro lado, la expresión de Mfn-2 se encontró significativamente aumentada en los ratones pre-diabéticos, tanto en WT (53.6±12.4%) como en AC3I (91.1±21.9%), en tanto la expresión de GRP75 se incrementó en los WT DRF (38.3±9.7%), pero no en los ratones AC3I DRF. La expresión de VDAC no se modificó en ninguna condición. Estas modificaciones en la expresión de las proteínas pueden relacionarse con la disminución en la distancia RS-mitocondria, que ya hemos descripto (J Physiol, 2017). Interesantemente, observamos por TEM una clara desorganización de la ultra estructura del tejido cardiaco y la presencia de uniones entre ambas organelas, que se corresponderían con los aumentos de Mfn-2 y/o GRP75, en los ratones WT DRF respecto de los WT DC.Finalmente, se observó una disminución en la capacidad buffer de las mitocondrias aisladas de animales DRF respecto de los DC (9.69±1.19 vs 14.2±2.17)Conclusión: Estos resultados nos permiten concluir 1. Que el incremento en la pérdida de Ca+2 por el RS se produce por un aumento de actividad de los canales de RyR2 como consecuencia del aumento de la actividad de CaMKII, 2. El incremento en la expresión de GRP75 y Mfn-2 podría explicar la mayor proximidad entre SR-mitocondria observada en corazones pre-diabéticos 3. El aumento de la actividad de los RyR2 y de la pérdida de Ca+2 en diástole asociado con la mayor asociación RS-mitocondria, aumentaría el tráfico de Ca+2 hacia esta última, sobrecargándola y disminuyendo su capacidad buffer. 4. Por último, la desorganización del tejido pre-diabético podría estar vinculada con las alteraciones observadas.