Los corazones pre-diabéticos presentan alteraciones en el manejo del Ca2+ y cambios ultra-estructurales y mitocondriales que afectan la comunicación RS-mitocondria

FEDERICO MARILÉN ; LÓPEZ SOFÍA; ZAVALA MAITE; VICO TAMARA; PORTIANSKY ENRIQUE,; ALVAREZ SILVIA; VILLA ABRILLE CELESTE; MATTIAZZI ALICIA; PALOMEQUE JULIETA

La Plata

Jornada; Jornadas de Investigación 2019; 2019

Facultad de Ciencias Médicas de la UNLP

Introducción: La diabetes mellitus tipo 2 (DMT2) es una patología con una alta incidencia a nivel mundial y en constante aumento. Los pacientes con DMT2 no controlada desarrollarán miocardiopatía diabética, siendo esta última una de las principales causas de muerte en pacientes con DMT2. La DMT2 se encuentra precedida por un estado metabólico de tolerancia a la glucosa alterada o pre-diabetes, que en la mayoría de los casos no es diagnosticado ni tratado. Nuestro grupo de trabajo ha demostrado en modelos animales de pre-diabetes alteraciones cardiacas, como arritmias y apoptosis. Ambas alteraciones son dependientes de un manejo alterado de calcio (Ca2+) y de la actividad de la enzima calcio-calmodulina kinasa II (CaMKII). Por otro lado, también hemos descripto alteraciones a nivel mitocondrial como son el swelling o hinchamiento mitocondrial y el potencial de membrana mitocondrial, que se encuentran alterados en ratones pre-diabéticos. Sin embargo, en este modelo, no se ha estudiado aún qué efectos genera el manejo alterado de calcio a nivel mitocondrial. Por lo que nuestra hipótesis es que en los corazones pre-diabéticos hay alteraciones en el manejo del calcio, que afectan la función mitocondrial, debido a una mayor comunicación entre el retículo sarcoplasmático (RS) y la mitocondria, por aumento de la expresión de proteínas que participan en esta comunicación como Mfn-2, GRP75 y VDAC, afectando así la actividad mitocondrial y en consecuencia la actividad del corazón pre-diabético. Objetivos: Estudiar el comportamiento del Ca2+ a nivel citosólico y mitocondrial, evaluar las proteínas y enzimas que se encuentran involucradas en un manejo de Ca2+ alterado y dilucidar si estos cambios afectan la actividad y estructura mitocondrial en corazones pre-diabéticos.Resultados: Para obtener los siguientes resultados utilizamos ratones C57 como cepa wild type y ratones AC3I, que poseen un péptido inhibidor de la enzima CaMKII a nivel del corazón. Para comenzar a evaluar nuestra hipótesis, se evaluó el manejo del Ca2+ citosólico por microscopia confocal y se observó que los cardiomiocitos de corazones pre-diabéticos poseen un aumento en la perdida de Ca2+ como chispas (sparks, 0.005±0.0032 vs 0.215±0.079) u ondas (waves, 0.022±0.0072 vs 0.066±+0.0209) desde el RS respecto del control, sin cambios en ratones AC3I tanto controles como pre-diabéticos. Para determinar si esta pérdida de Ca2+ era generada por un aumento de la actividad del receptor de rianodina 2 (RyR2) utilizamos la técnica de unión de rianodina tritiada ([3H]Ry) y encontramos un aumento significativo de la actividad máxima (Vmax) del RyR2 en los razones pre-diabéticos (47.82±7.16) respecto de los ratones control (30.79±6.39), sin diferencias significativas de ratones AC3I pre-diabéticos (27.71±10.1) con respecot a los controles. Debido a las alteraciones mitocondriales ya encontradas, estudiamos si se encontraban sobrecargadas de Ca2+ mediante espectrofluorometría y observamos una disminución en la capacidad de retención de calcio (CRC) en ratones pre-diabéticos (2.86±0.45) respecto de ratones controles (4.76±0.77). El Ca2+ mitocondrial es esencial para el metabolismo, pero superando cierto umbral se vuelve deletéreo. Por ello medimos el consumo de oxígeno, la producción de ATP y de H2O2 en mitocondrias aisladas y no se encontraron cambios significativos. Sumado a esto, buscamos alteraciones estructurales en estas organelas, y observamos que en mitocondrias de corazones pre-diabéticos se produce un aumento en el número de las mismas, y estas poseen menor diámetro y mayor redondez. A su vez, mediante western blot se evaluaron proteínas relacionas con procesos de fisión (Drp-1) y fusión (OPA-1) que cuando se encuentran desbalanceados son deletéreos. Los resultados indicaron un aumento en la expresión de DRP-1 en corazones pre-diabéticos (123.8±8.97 vs 100±4.48) sin cambios en OPA-1. Finalmente evaluamos si las pérdidas de Ca2+ podrían estar involucradas en estos cambios mitocondriales. Para ello se observó el tejido cardiaco por microscopia electrónica y se encontró una disminución significativa en la distancia RS-mitocondria en corazones pre-diabéticos. Por último, evaluamos las proteínas que participan en el anclaje de ambas organelas mediante western blot como son Mfn-2, GRP-75 y VDAC, y encontramos un aumento significativo en GRP-75. Conclusiones: Los ratones pre-diabéticos presentan un aumento en la perdida de Ca2+ a través del RyR2, dado por aumento en su actividad debido a la acción de CaMKII. Este Ca2+ estaría sobrecargando las mitocondrias y disminuyendo su CRC. La sobrecarga de Ca2+ en la mitocondria está generando procesos dirigidos a compensar la actividad del corazón, generando un aumento en los procesos de fisión y cambiando su morfología. Este proceso se ve fuertemente influenciado por la disminución de distancia entre organelas, fomentada por el aumento en GRP-75, que genera una mayor comunicación RS-mitocondria.