“Proteasas del polen de Acacia caven (Mol.) Molina. Aplicación a la síntesis de péptidos y en detergentes”.

CRISTINA BARCIA; EVELINA QUIROGA; GUSTAVO QUIROGA; SONIA BARBERIS

San Luis. Argentina.

Congreso; III Encuentro Regional de Biocatálisis y Biotransformaciones (III EnReBB); 2008

Red Latinoamericana de Biocatálisis y Biotransformaciones

Las proteasas son enzimas que hidrolizan proteínas y catalizan la síntesis de péptidos en medios no acuosos, entre los que se encuentran los solventes orgánicos. El uso de proteasas en síntesis de péptidos tiene numerosas ventajas con respecto a la síntesis química. Sin embargo, se requieren enzimas con alta estabilidad en dichos medios. Por otra parte, las proteasas son muy importantes en la industria. Las proteasas alcalinas son de particular interés debido a sus aplicaciones como aditivos en la industria de los detergentes. Sin embargo, hay poca información sobre la compatibilidad de las proteasas alcalinas con los ingredientes de los detergentes. El objetivo del presente trabajo es investigar las propiedades de las proteasas del polen de Acacia caven (Mol.) Molina para ser aplicadas a la síntesis enzimática de péptidos y como ingredientes de los detergentes. Se preparó un extracto crudo (EC) de polen de Acacia caven, colocando 1 g de polen en 10 ml de solución salina normal y agitando la mezcla a 200 rpm, por 24 h a 4°C. Se centrifugó 1 h a 14000 rpm, se separó el sobrenadante (conteniendo las proteínas solubles) y se conservó el mismo a -20°C para posteriores estudios. La actividad específica del EC se expresó como: UI/mg de proteínas, utilizando BAPNA como sustrato; y Ucas/mg de proteínas, utilizando caseína como sustrato. Se estudió el efecto del pH y la temperatura sobre la actividad proteolítica del EC, obteniéndose un pH óptimo de 8 y una temperatura óptima de 25°C. Se analizó la estabilidad térmica, y se encontró que el EC mantuvo el 100 % de la actividad caseinolítica residual en el rango de 25 a 60 °C durante 90 min. Se determinaron las preferencias del EC frente a diferentes sustratos sintéticos (N-a-Z-Aminoácidos-p-nitrofenil éster). El EC mostró alta actividad frente a los derivados de Phe, Ala, Gln y Pro, respectivamente. Se examinó el efecto de diferentes inhibidores de proteasas (E64, PMSF, pepstatin, EDTA y SDS) a 0,1, 1 y 10 mM, a 0, 10 y 30 min. El EC fue inhibido totalmente por PMSF (inhibidor de proteasas serínicas); mientras que E64 solo inhibió al EC a 30 min. Se evaluó el efecto de diferentes surfactantes (no-iónicos y aniónicos) al 2% sobre la actividad enzimática remanente después de 60 min a 25 – 60 °C. En la mayoría de ellos, el EC retuvo una importante actividad inicial. Se estudió el efecto de los solventes orgánicos, con diferente hidrofobicidad y grado de hidratación, sobre la actividad residual del EC. Se seleccionaron los medios más promisorios para los ensayos de síntesis de péptidos.   En las reacciones de síntesis, la selección del donante de acilo y del nucleófilo se basó en las preferencias del EC por los N-a-Z- Aminoácido-p-nitrofenil ésteres. El EC y el nucleófilo fueron disueltos en buffer, en tanto que cada donante de acilo fue disuelto en la fase orgánica. La reacción de condensación comenzó cuando ambas fases fueron puestas en contacto, y transcurrió durante 72 h, a 200 rpm y temperatura controlada. A diferentes intervalos de tiempo se tomaron muestras para su análisis.  En forma paralela, se hicieron dos tipos de blancos: uno sin enzima y respetando las condiciones del ensayo, y otro con la enzima sola en el medio de reacción. Los productos sintetizados y los sustratos se analizaron por TLC, RP-HPLC y MS. En conclusión, a través del presente estudio quedó demostrado que las proteasas del polen de Acacia caven (Mol.) Molina pueden ser aplicadas a la síntesis enzimática de péptidos y como ingredientes de los detergentes.