Determinación en orina de dos diuréticos prohibidos en el deporte usando inmovilización sobre membranas de nylon y detección fluorescente

Lanús (Bs. As.)

Congreso; XXVIII Congreso Argentino de Química y 4to. Workshop de Química Medicinal; 2010

QUÍMICA ANALÍTICA   DETERMINACIÓN EN ORINA DE DOS DIURÉTICOS PROHIBIDOS EN EL DEPORTE USANDO INMOVILIZACIÓN SOBRE MEMBRANAS DE NYLON Y DETECCIÓN FLUORESCENTE     Cecilia M. Peralta1, Liliana P. Fernández1,2, Adriana N. Masi*1,2   1 Instituto de Química de San Luis (INQUISAL-CONICET). 2 Área de Química Analítica. Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia. Chacabuco y Pedernera. Universidad Nacional de San Luis. 5700 - San Luis. ARGENTINA. E-mail: cperalta@unsl.edu.ar     Introducción Amilorida (AMI) y furosemida (FUR) son drogas ampliamente utilizadas en varias formulaciones farmacéuticas como diuréticos, que se administran para numerosas indicaciones terapéuticas como hipertensión arterial, insuficiencia cardíaca, y cirrosis hepática ya que aumentan la tasa de formación de orina, aumentando la excreción de electrolitos, sobre todo el sodio, el cloruro y el agua [1,2]. AMI y FUR han sido incluídas por el Comité Olímpico Internacional en la lista de sustancias prohibidas. La prohibición es principalmente debida a dos factores: (1) estas drogas permiten una rápida disminución del peso corporal (un factor importante en deportes donde las categorías de peso están implicadas) y (2) esto oculta la ingestión de otros agentes prescritos, porque la abundante cantidad de líquido eliminado reduce su concentración en la orina.   Materiales y métodos             Las muestras de orina y las soluciones estándares a pH 11 fueron filtradas a través de membranas de poliamida Millipore o Gamafil, colocadas en un soporte para filtros. La solución filtrada se reserva y la membrana se coloca en el soporte para muestras sólidas del espectrofluorómetro Shimadzu RF-5301PC usando λex 365 y λem 406 nm para la determinación de AMI. Las soluciones filtradas fueron acondicionadas a pH 2 y llevadas al espectrofluorómetro, usando λex 237 y λem 415 nm para la determinación de FUR.   Resultados Los espectros de excitación y de emisión fluorescente de AMI y FUR en solución acuosa muestran superposición. Este problema puede ser solucionado  separando los analitos a través de la membrana de poliamida. Además el espectro fluorescente exhibido por la orina presenta una importante superposición con el espectro de emisión de AMI. En un trabajo previo [3], fue desarrollado un método fluorimético para la determinación de AMI y FUR en formulaciones farmacéuticas. Con este propósito, fueron optimizados los parámetros instrumentales que influencian la determinación. Como resultado, fue seleccionado el pH 11 (ajustado con NaOH) para la filtración y determinación de AMI (sobre la membrana de poliamida no polar, la molécula de AMI debe estar en su forma neutral para asegurar una retención cuantitativa). En soluciones básicas, los iones hidroxilos pueden reaccionar con la AMI para producir especies neutras, las cuales pueden ser retenidas sobre la membrana. Por el contrario, a pH por encima de 5 FUR se encuentra predominantemente cargada en su forma negativa y no es retenida por la membrana de nylon no polar. Para la determinación de FUR, fue seleccionado el pH 2.7 (ajustado con HCl). La máxima intensidad de fluorescencia de FUR a pH 2.7 podría ser explicada por la presencia de un grupo carboxílico totalmente no disociado, que puede formar uniones de hidrógeno intramoleculares con los grupos carboxílicos de otras moléculas de FUR. Esta unión, que implica la parte del fluoróforo, otorga una rigidez adicional a la molécula de FUR que produce un aumento en la emisión fluorescente. Basándose en un criterio de selectividad, sensibilidad, y reproducibilidad, las longitudes de onda de las bandas características lex 365, lem 406 and lex 237, lem 415 fueron seleccionadas para determinar AMI y FUR, respectivamente. Una velocidad de flujo de filtración de 4 mL min−1 fue seleccionada como óptima. Mientras la membrana de nylon conserva la AMI, la forma aniónica de FUR no es retenida por el disco, y puede ser espectrofluorimétricamente determinada en la solución filtrada. AMI es inmovilizada sobre la membrana de poliamida, el incremento de rigidez en la molécula produce una muy favorable condición para la emisión fluorescente, mostrando un alto espectro fluorescente. Además, la preconcentración producida por el proceso de quimiofiltración brinda un beneficioso realzamiento de la señal fluorescente. Este método de separación también demuestra su eficacia para eliminar la interferencia de la orina, la cual es una matriz altamente fluorescente.   Parámetros analíticos. Validación.             La ecuación del gráfico de calibración es F = h + mC. Donde F es la intensidad fluorescente relativa y C la concentración de AMI o FUR. El rango de linealidad fue desde 3.7 x 10-4 a 0.8 µg mL-1 y desde 1.2 × 10−3 a 4.0 µg mL-1, para AMI y FUR, respectivamente, con un límite de detección de 1.1 × 10−4 y 3.5 × 10−4 µg mL-1.             Para validar ambas metodologías, se aplicó el método de adición estándar. La recuperación intra e inter día fue de 91.5 a 109.5 %, con una desviación estándar relativa menor que 7,9 % en todos los casos.   Conclusiones Un método nuevo, simple y eficiente es propuesto para la determinación secuencial de AMI y FUR en orina. La muestra es resuelta usando fluorescencia en fase sólida para suprimir el fondo fluorescente de la orina y eliminar la superposición de espectros entre AMI y FUR. El uso de un soporte, combinado con el uso de fluorimetría, contribuye a incrementar tanto sensibilidad como selectividad, mejorando simultáneamente la separación (retención), preconcentración y detección de los analitos. En conclusión, el método descripto satisface los específicos requerimientos de precisión, linealidad y sensibilidad para la cuantificación de AMI y FUR en muestras de orina. Además, el procedimiento es más barato que otros previamente descriptos. Todos estos factores hacen de este método una útil herramienta para el monitoreo de niveles de AMI y FUR en pequeños volúmenes de muestras de orina.   Referencias [1] W.O. Foye, T.L. Lemke, D.A. Williams, Principles of Medicinal Chemistry, fourth ed. Williams and Wilkins, USA, 1995, p. 405. [2] A. Gringauz, Introduction to Medicinal Chemistry-How Drugs Act and Why. Wiley-VCH Inc, New York, USA, 1997, p. 461. [3] C.M. Peralta, L.P. Fernández, A.N. Masi, A novel application of immobilization on membranes for the separation and spectrofluorimetric quantification of amiloride and furosemide in pharmaceutical samples, Anal. Chim. Acta 661 (2010) 85–90.