Inmunosensor microfluido aplicado al diagnóstico de la Enfermedad de Chagas

NANCY V. PANINI; SIRLEY V. PEREIRA; MARTÍN FERNÁNDEZ BALDO; GERMÁN A. MESSINA; ELOY SALINAS; MARÍA I. SANZ; JULIO RABA

San Miguel de Tucumán

Congreso; XXVII Congreso Argentino de Química; 2008

Asociación Química Argentina

Inmunosensor microfluido aplicado al diagnóstico de la Enfermedad de Chagas Nancy V. Panini, Sirley V. Pereira, Martín Fernández Baldo, Germán A. Messina, Eloy Salinas, María I. Sanz, Julio Raba INQUISAL, Departamento de Química, Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional de San Luis, Chacabuco y Pedernera 5700, San Luis, Argentina. E-mail: vpanini@unsl.edu.ar Introducción La enfermedad de Chagas (Tripanosomiasis americana), es causada por el Trypanosoma cruzi (T. cruzi) parásito protozoario hemoflagelado, esta enfermedad afecta aproximadamente a 18 millones de personas en la región endémica de Centro y Sur América1. El vector transmisor de este hemoflagelado es un insecto hemotófago de la Familia Reduviidae comúnmente conocido como vinchuca. Debido a la inexistencia de una quimioterapia eficiente para los pacientes infectados, el control de la enfermedad de Chagas se restringe al control del insecto transmisor con insecticidas y a la investigación serológica de los donantes de sangre2. El diagnóstico etiológico de la tripanosomiasis americana, está basado en la  presencia de anticuerpos contra el protozoo parásito hemoflagelado en sueros de individuos infectados. Estos anticuerpos son detectados por métodos inmunológicos que usan la alta especificidad de la unión antígeno-anticuerpo para medir la presencia de anticuerpos contra el parásito en sueros humanos. Los inmunoensayos con detección electroquímica presentan algunas ventajas sobre la mayoría de las técnicas espectrofotométricas, disminuyen considerablemente el límite de detección y el tiempo del ensayo, empleando anticuerpos marcados con enzimas (conjugados) que generen un producto activo electroquímicamente.3-12 Metodología El cuerpo principal de la celda fue construido de Pexiglas. La detección de anticuerpos presentes en la enfermedad de Chagas, fue realizada en un inmunosensor microfluido acoplado a un electrodo de trabajo de oro en cuya superficie se inmovilizaron antígenos purificados de T. Cruzi, los anticuerpos presentes en el suero de pacientes reaccionan inmunológicamente con los antígenos, y la cantidad de anticuerpo unido es cuantificado por H2O  H2O2 e- P Q      Ab-HRP(red)         Ab-HRP(ox)  un anticuerpo secundario específico para Ig G humana marcado con la enzima peroxidasa (HPR), usando como mediador enzimático 4-terbutilcatecol (4-TBC). HPR, en presencia de peróxido de hidrogeno (H2O2) cataliza la oxidación de 4-ter-butilcatecol (4-TBC), el cual es reducido electroquímícamente y detectado sobre la superficie del electrodo de oro a -0.1 V. La corriente resultante obtenida desde el producto de reacción es proporcional a la actividad de la enzima, y consecuentemente, a la cantidad de anticuerpo unida a la superficie del inmunosensor de interés. Resultados             Las muestras de suero fueron obtenidas de individuos con edades de 25-75 años procedentes de San Luis, Argentina, área endémica de Chagas. Se determinó la presencia de anticuerpos anti-T cruzi por ensayos ELISA, hemoaglutinación indirecta e inmunofluorescencia indirecta. Seguidamente, se uso el reactor electroquímico y se construyó una curva de calibración conociendo la concentración de HPR y la respuesta amperométrica del producto enzimático generado por HPR unida al anticuerpo secundario anti IgG humana, la cual es proporcional a la concentración de anticuerpos IgG presentes en suero específicos para T. cruzi. Se obtuvo una curva de calibración lineal en el rango de 0.1-1.50 mIU ml-1 (expresada como la actividad del conjugado). La ecuación de regresión lineal fue  I(nA)= 3.02 + 5.03x10-5 C con un coeficiente de relación lineal r= 0.998, S.D. = 6.65x10-7. El inmunoreactor acoplado a sistemas microfluidos puede ser usado para determinar más de 30 muestras de suero. Correlación entre el método propuesto y el ensayo espectrofotométrico comercial Y = A + B * X Y= 0,273 + 0,696 * X     R= 0,984  DE= 0,0255   n= 15 Conclusiones El inmunosensor microfluido acoplado a un sistema de inyección en flujo (IF) demostró cuantificar de manera rápida y sensible, anticuerpos específicos para T. cruzi en niveles muy bajos presentes en suero de pacientes. El dispositivo de microfluidos es capaz de cuantificar los componentes activos electroquímicamente presentes en el microcanal del sistema. Este sensor se basa en un detector amperométrico que mide la corriente generada por la reducción del mediador electroquímico 4-terbutil- o-benzoquinona a 4-TBC.  Estas medidas requieren 3-10 µL de suero y se realizan en muy pocos minutes. Para la detección electroquímica y el procedimiento de ELISA, el DL fue 0.04 y 0.38 mIU mL-1, respectivamente. Este resultado demostró que la detección electroquímica es más sensible que el método espectrofotométrico. El tiempo total de ensayo (20 min) es mas corto que el tiempo requerido para un ensayo ELISA comercial (100 min), sin reducción de selectividad, lo cual es una importante ventaja. Además se minimiza el consumo de reactivos caros, muestra estabilidad física y química, bajas corrientes de fondo, amplio rango de potencial de trabajo y exactitud. En conclusión, este inmunosensor es capaz de medir los mismos niveles de anticuerpos específicos para T. cruzi presentes en muestras de suero que los detectados por métodos convencionales, mostrando bajo límite de detección, velocidad y simplicidad. Referencias 1.      Y. Carlier,  J.C. Pinto Dias, A. Ostermayer Luquetti, M. Hontebeyrie, F. Torrico, C. Truyens,  Editions Scientifiques et médicales Elsevier SAS tdr, editors. Encycl. Méd. Chir., Paris 8-505-A (2002) 20:21. 2.      2- A. Moncayo, Chagas’ Disease, World Health Organization, Geneva, Tropical Disease Research, Eleventh Program Report, (1993) 67–75. 3.      J.M. Van Emon, V. 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