INMUNOSENSOR MICROFLUIDO PARA LA CUANTIFICACIÓN DE INTERLEUCINA-6 (IL-6) EN MUESTRAS DE SUERO HUMANO

SIRLEY V. PEREIRA; MARTIN FERNANDEZ BALDO; ELOY SALINAS; JULIO RABA; GERMÁN A. MESSINA

San Miguel de Tucumán

Congreso; XXVII Congreso Argentino de Química “Dr. josé Pedro Aymonino”; 2008

Asociación Química Argentina

INMUNOSENSOR MICROFLUIDO PARA LA CUANTIFICACIÓN DE INTERLEUCINA-6 (IL-6) EN MUESTRAS DE SUERO HUMANO Sirley V. Pereira, Martín Fernández Baldo, Eloy Salinas, Julio Raba, Germán A. Messina INQUISAL, Departamento de Química, Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional de San Luis, Chacabuco y Pedernera 5700, San Luis, Argentina. E-mail: messina@unsl.edu.ar Introducción La interleucina-6 (IL-6) es una citoquina pleiotrópica que posee un rol crítico en la respuesta inflamatoria, ha sido implicada en la patogénesis de numerosas condiciones inflamatorias, así como: psoriasis, artritis reumatoidea, enfermedades cardiovasculares y enfermedad inflamatoria intestinal. Por otro lado numerosas evidencias indican que  IL-6 posee un rol crucial en condiciones linfoproliferativas. IL-6 ha mostrado ser  un factor de crecimiento para células de mieloma múltiple. IL-6 es también un factor de crecimiento para linfocitos B inmortalizados con el virus de Epstein Barr, la producción de esta citoquina ha sido demostrada especialmente en personas de edad avanzada. Las enfermedades linfoproliferativas de células B asociadas con la infección del virus de Epstein Barr podrían llevar a serias complicaciones luego del transplante de médula ósea. Normalmente los niveles séricos de IL-6 son menores de 4 pg/ml. Por todo esto la determinación de niveles de IL-6 es muy útil para diagnóstico clínico. Varios métodos se han desarrollado para la determinación de IL-6 como: radioinmunoensayo, enzimoinmunoensayo, ensayos en columna de inmunoafinidad, ensayos por fluorometría etc. Estas técnicas desafortunadamente requieren personal altamente capacitado, instrumental sofisticado además de consumir mucho tiempo. Por lo tanto el desarrollo de un nuevo método con mayor sensibilidad y especificidad sería sumamente útil. Este trabajo describe un inmunosensor integrado a microfluidos, capaz de detectar IL-6 en muestras de suero humano, usando detección electroquímica en un formato de biochip. Metodología El cuerpo de la celda fue construido de Pexiglas. La Figura 1 ilustra el flujo a través de la cámara contenida en el interior del inmunosensor microfluido y el sistema de detección. La  detección de IL-6 fue realizada con un inmunoensayo tipo sándwich, basado en el uso de un anticuerpo monoclonal anti-IL-6 inmovilizado sobre vidrio de porosidad controlada modificado con grupos 3-aminopropilo (APCPG) depositado en el canal central del sistema microfluido. La IL-6 presente en muestras de suero reacciona inmunológicamente con el anticuerpo anti-IL-6 inmovilizado y con el segundo anticuerpo específico unido a biotinia. Luego del lavado, se adiciona la enzima fosfatasa alcalina marcada con estreptavidina. El sustrato p-aminofenilfosfato (Papp) por acción de la fosfatasa alcalina se oxida a p-aminofenol (pAP) y el producto electroactivo de la reacción se cuantificó sobre un electrodo de oro a 0,10V, ubicado al final del canal. La corriente obtenida por oxidación del producto de la reacción enzimática es proporcional a la actividad de la enzima y consecuentemente a la concentración de IL-6 unida en la superficie del inmunosensor. Fig.1 Representación esquemática del inmunosensor., RE: electrodo de referencia; WE: electrodo de oro; AE: contraelectrodo; GF: fibra de vidrio; AP-CPG: vidrio de porosidad controlada modificado; CC: canal central. Resultados La optimización del sistema microfluido es esencial para el control de la volumen minuto. Todos los reactivos y soluciones de lavado fueron inyectados usando sistema de micro-jeringas. La velocidad de flujo de reactivos y muestras tienen efecto sobre la eficiencia de la interacción antígeno-anticuerpo, ya que a diferencia del inmunoensayo convencional, las muestras y reactivos fluyen continuamente a través del sistema microfluido. El estudio de la velocidad de flujo  en un rango de 1 a  5 µL min-1   prácticamente no tuvo  efecto sobre la reacción imune. Para una velocidad de flujo  mayor a 8 µL min-1  la señal se reduce drásticamente. Por consiguiente, una velocidad de 5µL min-1  fue usada para la inyección de reactivos y buffers de lavado. Los volúmenes de muestra estudiados abarcaron un rango de 10 a 40 μL. La sensibilidad fue triplicada en un rango de 10 a 25μL. Las diferencias fueron insignificantes para mayores volúmenes de muestra La tasa de respuesta enzimática fue estudiada  bajo condiciones de   pH  8-10 en buffer DEA y mostró  máxima actividad a pH 9.6. El valor de pH utilizado fue entonces de 9.6 en buffer DEA. Los efectos de variación de la concentración de pAPP desde  0.1 a 5mM sobre la respuesta enzimática también fueron evaluados. La concentración óptima encontrada fue de 2.7 mM. Bajo las condiciones seleccionadas descriptas anteriormente, la respuesta electroquímica del producto de la reacción enzimática fue proporcional a la concentración de IL-6 en suero. El tiempo total del ensayo, incluyendo pasos de  inyección - deyección  para la medición de IL-6 fue menor a 25 min (mucho menor que las 5 hs que toma la determinación de IL-6 por métodos convencionales de ELISA) el cual es 12 veces más rápido que el método en microplaca. El sistema electroquímico fue comparado con el sistema espectrofotométrico comercial para la cuantificación de IL-6 en 24 muestras de suero humano (Figura 2). Las pendientes obtenidas fueron cercanas a 1, indicando una buena correspondencia entre los 2 métodos. Comparado con el método ELISA, nuestro método muestra una importante mejora en la sensibilidad. Fig 2. Correlación entre el método propuesto y el método espectrofotométrico comercial. Una curva de calibración lineal para la detección de IL-6 en suero fue elaborada en un rango de (0-400 pg mL-1). La ecuación de regresión lineal fue i=7.71584 +1.54 CtPSA, con un coeficiente de regresión lineal  r=0.998. El coeficiente de variación (CV) para la determinaron de 100 pg mL-1 de IL-6 fue menor del 4.3% (seis replicas). Para la detección electroquímica  y el procedimiento de ELISA  el dl fue de 0.41 y 1.56 pg mL-1,respectivamente. Estos resultados sugieren que la concentración detectable de IL-6 en este sistema es  aplicable a niveles clínicos  y la sensibilidad  lograda detecta concentraciones de IL-6 en pacientes cuyos niveles de esta citoquina es muy baja. Conclusiones Este estudio desarrolló un inmunosensor acoplado a un sistema de microfluidos con inyección en flujo (FI) y detección electroquímica, para la rápida, sensible y selectiva cuantificación de IL-6 en suero de pacientes con niveles muy bajos de esta citoquina. El tiempo total del ensayo es de 25 min, mucho menor que las 5 hs normalmente usadas para llevar a cabo una determinación por ELISA tradicional, por lo tanto es 12 veces mas rápido que el método en microplaca, no habiéndose encontrado reducción de la selectividad. También minimiza el gasto de reactivos  costosos, muestra estabilidad física y química, baja corriente de fondo, amplio rango de potencial  de trabajo y  buena exactitud. Referencias [1] J. Van Snick, Interleukin-6: an overview, Ann. Rev. Immunol. 8 (1990) 253–278. [2] G.A. Roselle, C.L. Mendenhall, Alteration of in vitro human lymphocyte function by ethanol, acetaldehyde and acetate, J. Clin. Lab. Immunol. 9 (1982) 33–37. [3] A.H. Swiergiel, A.J. Dunn, Feeding, exploratory, anxiety- and depression-related behaviors are not altered in interleukin-6-deficient male mice, Behav. Brain Res. 171 (2006) 94–108. [4] H. Shin,Y. Lee,Y. Chang, J. Lee, B. Kim, K. Min, Y. Kim, Suppression of interleukin-6 production in macrophages by furonaphthoquinone NFD-37, Int. Immunopharmacol. 6 (2006) 916–923. [5] F. Olivieri, M. Bonafe, S. Giovagnetti, R. Stecconi, M. Cardelli, L. Cavallone, In vitro IL-6 production by EBV-immortalized B lymphocytes from young and elderly people genotyped for 174 C/G polymorphism in IL-6 gene: a model to study the genetic basis of inflammation, Mech Ageing Dev. 124 (2003) 549-553. [6] J.M. Marugán Miguelsanz1, M.A. Suárez Rodríguez, L.M. Rodríguez Fernández1, J.M. García Ruiz de Morales, Niveles normales de interleukinas 6 y 8 en suero y orina de niños sanos asintomáticos. BSCP Can. Ped. 30 (2006) 47-55. [7] J.H. Cho, S.M. Han, E.H. Paek, I.H. Cho, S.H. Paek, Plastic ELISA-on-a-chip based on sequential cross-flow chromatography, Anal. Chem. 78 (2006) 793–800. [8] K.S. Kim, J.K. Park, Magnetic force-based multiplexed immunoassay using superparamagnetic nanoparticles in microfluidic channel, Lab on a Chip 5 (2005) 657–664. [9] S.C. Tadic, G. Dernick, D. Juncker, G. Buurman, H. Kropshofer, B. Michel, C. Fattinger, E. Delamarche, High-sensitivity miniaturized immunoassays for tumor necrosis factor α using microfluidic systems, Lab on a Chip 4 (2004) 563–569. [10] G. Gübitz, C. Shellum, Flow injection immunoassays, Anal. Chim. Acta 283 (1993) 421–428. [11] ChemiKineTM Human Interleukin-6 (IL-6)  Sandwich ELISA Kit for the quantitative determination of IL-6. (2004) CHEMICON® International, Inc. USA & Canada, (Instruction Manual).