Desarrollo de una inmuno-columna aplicada en la determinación de anticuerpos IgG específicos para Helicobacter pylori en muestras de suero humano

MARTIN FERNANDEZ BALDO; SIRLEY V. PEREIRA; FRANCO A. BERTOLINO; PATRICIA W. STEGE; ELOY SALINAS; JULIO RABA; GERMÁN A. MESSINA; MARIA I. SANZ

San Miguel de Tucumán, Argentina

Congreso; XXVII Congreso Argentino de Química “Dr. josé Pedro Aymonino”; 2008

Asociación Química Argentina

Desarrollo de una inmuno-columna aplicada en la  determinación de anticuerpos IgG específicos para Helicobacter pylori en muestras de suero humano Martín Fernández Baldo, Sirley V. Pereira, Franco A. Bertolino, Patricia W. Stege, Eloy Salinas, Julio Raba, Germán A. Messina, María I. Sanz INQUISAL, Departamento de Química, Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional de San Luis, CONICET, Chacabuco y Pedernera 5700, San Luis, Argentina. E-mail: messina@unsl.edu.ar Introducción: Helicobacter pylori es un bacilo patógeno Gram negativo adaptado para colonizar la mucosa gástrica humana, infectando más de la mitad de la población global causando: úlcera péptica y gastritis crónica [1] y clasificado como carcinógeno de clase I. La enfermedad puede ser curada por erradicación de H. pylori a través de la aplicación de una triple terapia, compuesta por un inhibidor de la bomba de protones y dos o en algunos casos tres antibióticos (claritromicina, metronidazol y amoxicilina) [2]. Para prevenir el indiscriminado uso de múltiples antibióticos, teniendo en cuenta el alto grado de resistencia al tratamiento, es necesario un diagnostico preciso de la infección por este microorganismo. Los métodos disponibles para diagnosticar la infección por H. pylori pueden dividirse en: invasivos y no invasivos [3]. Los invasivos utilizan endoscopia para obtener una muestra de biopsia estomacal, la cual es analizada histológicamente y por cultivo en medios selectivos, para demostrar la presencia de H. pylori. De forma alternativa, el test de ureasa positivo realizado sobre la muestra de biopsia indica la presencia de H. pylori, debido a que éste produce gran cantidad de esta enzima [4]. Entre los no invasivos se encuentran la prueba del aliento de urea y los métodos serológicos. La metodología mayormente utilizada en la detección de anticuerpos para H. pylori es la técnica de ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) [5]. A pesar de que ésta es utilizada en la exámen clínico de rutina, su límite de detección es relativamente pobre cuando el sistema de detección utilizado es espectrofotométrico, siendo la causa de pérdida de sensibilidad [6]. Los enzimo inmunoensayos heterogéneos acoplados a un sistema de inyección en flujo y detección amperométrica son una poderosa herramienta analítica para la determinación de bajos niveles de analitos, tales como anticuerpos, hormonas, drogas, marcadores tumorales y virus [7].Los métodos electroquímicos ofrecen excelente sensibilidad, rapidez, y la característica de combinar instrumentación simple y bajo costo [8]. Este trabajo muestra el desarrollo de un método de cuantificación de anticuerpos IgG en suero humano para H. pylori basado en el múltiple uso de un antígeno de H. pylori inmobilizado sobre una columna inmunocromatográfica incorporada dentro de un sistema analítico de inyección de flujo (FI).Los anticuerpos en la muestra de suero son detectados por reacción inmunológica con el antígeno de H. pylori inmobilizado, y cuantificados por un segundo anticuerpo específico para IgG humana conjugado con la enzima fosfatasa alcalina (AP). p-Aminofenil-fosfato (PAPP) fue convertido a p-amino-fenol (pAF) por la acción de fosfatasa alcalina y el producto electroactivo fue cuantificado sobre un electrodo de carbono vítreo modificado con nanotubos de carbono a 0,30 V. La corriente obtenida por oxidación del producto enzimático es proporcional a la actividad de la enzima y consecuentemente a la concentración de anticuerpo unido a la columna inmunocromatográfica Metodología Flujo a través de la unidad de reacción/detección. Se utilizó una bomba peristáltica (Guisan Minipuls 3 peristaltic pump, Gilson Electronics, Inc. Middleton, WI) para introducir la muestra y parar el flujo a través de la inmuno-columna. La figura 1 ilustra el sistema de flujo y la unidad de detección. P: Bomba. C: Línea de Carrier. SI: Inyección de muestra. W: Desecho. IC: inmuno-columna. WE: GSPE. RE: Electrodo de pseudos-referencia. AE: Electrodo auxiliar. D: Unidad de detección. El dispositivo para detección amperométrica fue fabricado de teflón (figura 2).El electrodo de carbono vitrio modificado con nanotubos de carbono se ubica en la parte superior de la celda de deteccion, conectado al final de la inmuno-columna. El potencial aplicado al electrodo de trabajo fue 0,30 V vs Ag/AgCl como electrodo de referencia y un alambre de platino se usó como electrodo auxiliar. A este potencial la corriente catalítica fue bien establecida. La columna consistio en un tubo de Teflón (0.8 mm i.d. from Cole–Parmer, Chicago, IL, USA). La detección amperométrica fue realizada usando BAS LC-4C y BAS 100 B (electrochemical analyzer Bioanalytical System, West Lafayette, IN) fue usado para el análisis por voltametría cíclica. Inmunoensayo para anticuerpos específicos para H. pylori Las curvas de calibrado fueron realizadas utilizando estándares de un kit de ELISA comercial, una siguiendo las instrucciones del fabricante y la otra haciendo uso de la metodología por nosotros desarrollada. Las concentraciones de anticuerpo IgG específicos para H. pylori fueron detectados por cambios en las medidas de absorbancia a 450 nm y por técnicas electroquímicas respectivamente. Preparación de los antígenos de H. pylori. Los antígenos fueron preparados por sonicado de un cultivo de H. pylori [9]. Este fue realizado en un medio Agar Mueller-Hinton con 5% sangre carnero y fue incubado a por tres días a 37ºC. Las colonias obtenidas fueron recolectadas, lavadas, centrifugadas y resuspendido en buffer. Sobre esta preparación fue aplicado el sonicado. Síntesis de pAPP La síntesis de pAPP por hidrogenación catalítica de pNPP fue realizada siguiendo el procedimiento propuesto por AG Gehring y col [10] con modificaciones. El producto pAPP presento una pureza mayor al 98 % y fue determinado por NMR. Inmovilización de Antígenos de H. pylori: La columna inmunocromatográfica fue preparada por empaquetamiento de vidrio de porosidad controlada modificado con 3-aminopropilo, sobre el cual fueron inmobilizados los antígenos de H. pylori utilizando glutaraldehido. Resultados El método desarrollado fue aplicado en la determinación de de anticuerpos IgG específicos para H. pylori en 40 muestras de suero humano. Una curva de calibración lineal para la detección de anticuerpo IgG específico para H. pylori en suero fue realizada en un rango de  0-100 U ml-1.La ecuación de regresión lineal fue i=0,0125 + 0,031 CHp, con un coeficiente de relación lineal r = 0.998.El coeficiente de variación(CV) fue 3,2% (n=6). Para el Kit comnercial de ELISA se construyó la curva de calibración. La ecuación de regresión lineal fue A= 0,031 + 0,029 CHp con r = 0.996, el CV la determinación de 20 U ml-1  de anticuerpo específico de H. pylori fue de 4,7% (n=6). El límite de detección para el metodo propuesto y el Kit comercial fue 0,62 y 1,8 U ml-1 respectivamente. La sensibilidad para la detección electroquímica y el procedimiento ELISA convencional fue 0,031 µA/U ml-1 y 0.029 Abs/U ml-1 respectivamente. La precisión del ensayo fue evaluada con sueros controles con las siguientes concentraciones de anticuerpo específico:20, 50 y 100 U ml-1. El CV intraensayo fue de 3,2% y el coeficiente de variación interensayo fue del 5%. La inmunocolumna  fue comparada con un sistema espectrofotométrico comercial para la cuantificación de anticuerpos específicos de H. pylori en 40 muestras de suero.Las pendientes obtenidas fueros razonables cerrado para uno, indicando una buena correspondencia entre los dos métodos. Conclusiones En este trabajo se desarrolló una columna inmunocromatográfica acoplada a un sistema de inyección de flujo para la rápida, sensitiva y selectiva cuantificación de anticuerpos específicos contra H. pylori en muestras de suero humano. El total del tiempo del ensayo fue menor (25 minutos) que el tiempo para el kit comerciales de ELISA (160 minutos), sin reducir la selectividad, minimizando el costo de antígenos y otros reactivos, el sistema mostró estabilidad física, química y exactitud. En conclusión este sistema posee la ventaja de simplicidad del sistema ELISA para desarrollar una inmunocolumna que fue capaz de medir los mismos niveles de anticuerpos específicos contra H. pylori como detectado por métodos convencionales teniendo las ventajas de rapidez y simplicidad. Referencias [1] B.J. Marshall, J.R. Warren, Lancet 8390 (1984) 1311–1315. [2] W.A. de Boer, G.N.J. Tytgar, Br. Med. J. 320 (2000) 31–34. [3] A.F. Cutler, F. Havstad, C. Ma, M. Blaser, G.I. Perez-Perez, T. Schubert, Gastroenterology 109 (1995) 136– 141. [4] P.R. Hawtin, A.R. Stacy, D.G. Newell, J. Gen. Microbiol. 136 (1990) 1995–2000. [5] A.R. Stacy, G.D. Bell, D.G. Newell, in: G. Gasbarrini, S. Petrolani (Eds.), Basic and Clinical Aspects of H. pylori Infection, Springer, Berlin, 1998, p. 159. [6] A.M.G. Bosch, H. Van Hell, J. Brands, R.H.W.M. Schuurs, in: S.P. Pal (Ed.), Proceedings of the International Symposium on Enzyme Labeled immunoassay of Hormones and Drugs, Walter de Gruyter, Berlin, 1978, pp. 175–187. [7] G. Gu bitz, C. Shellum, Anal. Chim. Acta 283 (1993) 421–428. [8] A.G. Gehring, C.G. Crawford, R.S. Mazenko, L.J. Van Houten, J.D. Brewster, Journal of Immunological Methods 195 (1996) 15-25. [9] J.A. Turner, J.H. Christie, M. Vukovic, R.A. Osteryoung, Anal.Chem. 49 (1977) 1904. [10] G.A. Messina, A. Torriero, I. E. De Vito, Roberto A. Olsina, Julio Raba Analytical Biochemistry 337 (2005) 195–202