INMUNOSENSOR INTEGRADO A SISTEMAS MICROFLUIDOS MODIFICADO CON NANOTUBOS DE CARBONO PARA LA DETECCION DE ANTIGENO PROSTATICO ESPECIFICO (PSA) EN MUESTRAS DE SUERO HUMANO

NANCY V. PANINI; NOELIA A. MARTÍNEZ,; GERMÁN A. MESSINA,; ELOY SALINAS,; JULIO RABA

San Miguel de Tucumán

Congreso; XXVII Congreso Argentino de Química Dr. Pedro José Aymonino; 2008

Asociación

INMUNOSENSOR INTEGRADO A SISTEMAS MICROFLUIDOS MODIFICADO CON NANOTUBOS DE CARBONO PARA LA DETECCION DE ANTIGENO PROSTATICO ESPECIFICO (PSA) EN MUESTRAS DE SUERO HUMANO     Nancy V. Panini, Noelia A. Martínez, Germán A. Messina, Eloy Salinas, Julio Raba   INQUISAL, Departamento de Química, Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional de San Luis, Chacabuco y Pedernera 5700, San Luis, Argentina. E-mail: vpanini@unsl.edu.ar   Introducción De acuerdo con La Organización Mundial de la Salud (OMS), el cáncer de próstata es una de las enfermedades más comunes en el hombre y la segunda causa de mortalidad por cáncer en países en desarrollo. La mejor opción para  controlar y disminuir la tasa de mortalidad de esta enfermedad es su detección en estadios tempranos, cuando esta localizada y órgano-confinada. El Antígeno Prostático Especifico (PSA) ha sido identificado como el marcador tumoral mas relevante para el diagnostico temprano del cáncer de próstata y para el  monitoreo de su recurrencia luego del tratamiento. El PSA total (PSAt) representa la suma del PSA libre y PSA-complejado en suero. Los niveles de PSAt se incrementan significativamente durante el cáncer de próstata, siendo la concentración de PSAt en varones sanos menor a 4 ng/ml. Elevados niveles de este marcador están relacionados con la aparición de tumores en próstata. En este trabajo se desarrolló un inmunosensor acoplado a un electrodo de carbono vítreo modificado con  nanotubos de carbono multipared (MWCNT) (CNT-GCE) integrado a un sistema de microfluidos para una cuantificar de forma rápida y sensible el antígeno prostático especifico (PSA) en muestras de suero humano.             Metodología El método propuesto sigue los principios de un EIA. El cuerpo principal de la celda fue construido de Pexiglas. La Fig 1 ilustra el flujo a través de la cámara contenida en el interior del inmunosensor microfluido y el sistema de detección. El biosensor posee un disco rotatorio de teflón (3 mm de diámetro) que contiene inmovilizados Anticuerpos monoclonales de ratón (5G6) para PSA. PSA en muestras de suero reacciona inmunologicamente con el anti-PSAt inmovilizado y con un anticuerpo secundario especifico para PSA marcado con la enzima peroxidasa (HPR). HPR, en presencia de peroxido de hidrogeno (H2O2) cataliza la oxidación de 4-ter-butilcatecol (4-TBC), cuya reducción electroquímica fue detectada sobre CNT-GCE a -0.15V. La corriente resultante obtenida desde el producto de reacción es proporcional a la actividad de la enzima, y consecuentemente, a la cantidad de PSA unida a la superficie del inmunosensor de interés.   Fig.1 Representación esquemática de la cámara del sensor  microfluido, RE: electrodo de referencia; CE: contra  electrodo; RD: disco rotatorio. Todas las medidas fueron realizadas en milímetros. Resultados Una completa homogenización de reactivos es lograda, debido a que la celda de trabajo opera como una cámara de mezclado facilitando la llegada de los inmunoreactivos, el sustrato enzimático a los sitios activos y la liberación de  productos desde los mismos sitios. El resultado neto es mayores valores de corriente. Un incremento significativo de la señal eléctrica se observó  a velocidades entre 60 y 190 rpm. Si la rotación del disco es de 190 rpm, la señal es drásticamente ampliada. La señal de corriente obtenida como respuesta a la aparición del producto de la reacción enzimática es proporcional a la actividad del conjugado enzimático y en consecuencia, a la concentración de PSAt en las muestras de suero. El volumen de muestra fue evaluado en un rango de 2-20 µL. La sensibilidad es casi el triple en un rango entre 2 y 10 µL. La tasa de respuesta enzimática bajo condiciones de flujo detenido fue estudiada en un rango de pH 4-7 y muestra máximos valores de actividad a pH 5. El valor de pH usado fue 5.00 en buffer fosfato- citrato 0.1M. Para el método propuesto se obtuvo una curva de calibración para la detección de PSAt en suero, en un rango de (0-60 µg L-1) (Fig. 2). La ecuación de regresión lineal fue i=0.057+0.047 CtPSA, con un coeficiente de regresión lineal  r=0.998. El coeficiente de variación (CV) para la determinaron de 30 µg L-1 de PSAt fue menor del 3% (n=6).     Fig. 2. Curva de calibración para la determinación de PSAt por método amperometrico. Las medidas fueron realizadas a -0.15V a temperatura ambiente en una solución de buffer fosfato-citrato 0.1M (pH 5.0)conteniendo 1.0 x 10-3 mol L-1 de H2O2 y 1.0 x 10-3 molL-1 de 4-TBC.         El sistema electroquímico fue comparado con un sistema espectrofotométrico comercial para la cuantificación de PSAt en 32 muestras de suero. Las pendientes obtenidas fueron  cercanas a 1, indicando una buena correspondencia entre los dos métodos. Comparado con el EIA, el método propuesto mostró un gran incremento de sensibilidad. Estos resultados sugieren que la concentración detectable de PSAt en este sistema es similar a las determinadas en análisis clínicos, y la sensibilidad lograda permite determinar concentraciones de PSAt por debajo de las normales en suero de pacientes.   Conclusiones En este trabajo, se desarrolló un inmunosensor microfluido acoplado a un sistema de inyección en flujo (FI), para cuantificar en forma rápida y selectiva PSAt en suero de pacientes con muy bajos niveles de este, usando detección electroquímica. El tiempo total de prueba (30 min) fue menor que el tiempo reportado para el Kit ELISA comercial (100 min), sin reducción de selectividad, siendo esta una importante ventaja. También minimiza el derroche de reactivos caros; muestra estabilidad física y química, baja corriente de fondo,  funcionamiento en un amplio rango de potencial y estabilidad. La modificación del electrodo de carbono vítreo con nanotubos de carbono produce mejoramiento de la respuesta electroquímica obtenida por la reducción de 4-ter-butil o-benzoquinona a 4-TBC. En conclusión, aprovechamos la simplicidad del sistema ELISA para construir un inmunosensor que fue capaz de medir los mismos niveles de PSAt en muestras de suero humano como es detectada por métodos convencionales pero con la ventaja de tener bajo límite de detección, velocidad y simplicidad. En función de ampliar las aplicaciones en muchos campos, la miniaturización de los inmunosensores hará una contribución significativa a la rapidez y seguridad de análisis de productos químicos, patógenos y de moléculas biológicas.   Referencias 1.    Agüí, L., Peña-Farfal, C., Yáñez-Sedeño, P., Pingarrón, J.M., 2007a. 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