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Melatonina (MT), conocida como la ?hormona del sueño?, es una indolamina aislada en 1958 de la glándula pineal bovina [1]. Desde su descubrimiento, se desarrollaron diversos métodos para su determinación y evaluación de su variación circadiana en fluidos y tejidos biológicos. Sin embargo, la mayoría de estos métodos fueron desarrollados para su aplicación en tejidos animales. Esto llevó a que su estudio en plantas avance lentamente debido a la aplicación directa de estos métodos desarrollados para el análisis en vertebrados. Además, la susceptibilidad de esta molécula a la degradación y su naturaleza anfipática, han contribuido a la variabilidad de los resultados informados en la literatura científica [2].El presente trabajo se basó en el desarrollo de un procedimiento de extracción y cuantificación de MT en hojas de Arabidopsis thaliana. Posteriormente, se determinaron los niveles de esta hormona en diferentes estados del desarrollo de la planta, así como a lo largo del día y en diferentes condiciones de cultivo. Las muestras de hojas fueron liofilizadas y homogeneizadas con nitrógeno líquido previo a la extracción. Se optimizaron las variables para la extracción mediante la aplicación de una estrategia quimiométrica multivariada de diseño factorial completo. Se empleó un sistema UHPLC-(+)ESI-MS/MS para la separación, ionización, fragmentación y detección de MT. Se seleccionaron dos transiciones provenientes de la fragmentación del ión pseudomolecular de MT ([M+H]+ (m/z) = 233) para su identificación y cuantificación: 233 > 216 y 233 > 174. Los límites de detección (LOD) y de cuantificación (LOQ) fueron de 10 ng/L y 100 ng/L, respectivamente. Esta metodología permitió la cuantificación de MT en hojas de Arabidopsis thaliana en concentraciones en el orden de los nanogramos por gramo de materia seca. Se determinóque los valores de melatonina no fluctúan a lo largo del día y son mayores en plantas cultivadas bajo radiación natural.