Determinación de ocratoxina A en uvas mediante detección electroquímica utilizando nanopartículas magnéticas modificadas

MARTÍN A. FERNÁNDEZ BALDO; NOELIA A. MARTÍNEZ; FRANCO A. BERTOLINO; GERMÁN A. MESSINA; MARÍA I. SANZ; JULIO RABA

Lanús, Provincia de Buenos Aires

Congreso; XXVIII Congreso Argentino de Química "Bicentenario de Mayo", IV Workshop de Química Medicinal y II Reunión Latinoamericana de Química Medicinal; 2010

Asociación Química Argentina, Universidad Nacional de Lanús

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Fernández-Baldo, Noelia A. Martínez, Franco A. Bertolino, Germán A. Messina, Maria I. Sanz, Julio Raba*   INQUISAL, Departamento de Química. Universidad Nacional de San Luis, CONICET. Chacabuco 917. D5700BWS. San Luis, Argentina. jraba@unsl.edu.ar.     Introducción Ocratoxina A (OTA) o 7-carboxi-5-cloro-8-hidroxi-3,4-dihidro-3R-metilisocumarina-7-L-β-fenilalanina (Fig. 1) es una micotoxina natural producida por varias especies de Aspergillus (ej.: A. ochraceus) y Penicillium (ej.: P. verrucosum) que crecen en diversos productos agrícolas o durante su almacenamiento (1,2). OTA presente en alimentos que han sido almacenados en forma inadecuada, afecta al hombre, mediante el consumo de los mismos, ocasionándole efectos carcinogénicos. La Agencia Internacional de Investigación sobre el Cáncer (IARC) ha clasificado a OTA como un posible compuesto carcinógeno (grupo 2B, posiblemente por inducción del daño oxidativo del ADN) para los seres humanos (Organización Mundial de la Salud, 1996) ya que causa inmunosupresión e inmunotoxicidad (3,4). OTA se encuentra principalmente en alimentos derivados de plantas (5-8), en frutas (manzanas, naranjas, ciruelas, uvas y frutos secos) y jugos de fruta (manzana, uva y naranja). Debido a estos hallazgos, muchos países han establecido límites de los niveles de OTA en alimentos, por lo general entre 1 y 10 ppb (9). Por lo tanto, es de gran importancia desarrollar una metodología de bajo costo, rápida y fiable determinación de OTA en estas concentraciones. Diversas técnicas han sido utilizadas para la determinación de OTA en diferentes tipos de muestras como TLC, HPLC, etc (10), pero las mismas implican el uso de equipos costosos y en ocasiones derivatización del analito. También se han aplicado a la determinación de OTA el enzimo inmuno análisis (EIA) (11) y las técnicas electroquímicas (12-14). Estas últimas, presentan importantes ventajas en comparación con las técnicas tradicionales, tales como: sensibilidad, bajos costos de equipamiento, facilidad de manejo y respuesta rápida (15). Con el avance de la nanotecnología en el campo de la biotecnología y la medicina, las nanopartículas magnéticas (NPM) han recibido una considerable atención por sus propiedades (16). Dichas partículas permiten la inmovilización de diferentes elementos bioactivos tales como anticuerpos, antígenos, ADN, etc. El objetivo de este trabajo fue desarrollar un método preciso, sensible y selectivo para la determinación de OTA en muestras de uvas utilizando voltamperometría cíclica (VC) y voltamperometría de onda cuadrada (VOCO) para su caracterización y cuantificación respectivamente.   Metodología   Equipo Los experimentos electroquímicos se realizaron en soluciones sin agitación utilizando un analizador electroquímico BAS 100B/W (Bioanalytical System, IN, USA). Los voltamperogramas se obtuvieron utilizando un sistema de tres electrodos constituido por el de trabajo de carbón vítreo (ECV), referencia Ag|AgCl|3M NaCl y como contraelectrodo un alambre de Pt.   Procedimiento Para la determinación de OTA se puso en contacto la muestra con las NPM previamente modificadas con anticuerpos anti-OTA. Después de agitar durante 10 minutos la solución a temperatura ambiente, OTA presente en la muestra, reaccionó inmunológicamente con los anticuerpos anti-OTA inmovilizados sobre las partículas. Luego, estas partículas fueron removidas de la solución empleando un imán externo y trasvasadas cuantitativamente a una celda electroquímica con solución de desorción (ácido perclórico 0,2 M), después de 1 minuto, la OTA presente en la solución se determinó directamente usando VOCO. Por lo tanto, la corriente obtenida de la oxidación de OTA es directamente proporcional a la concentración de OTA en la muestra.   Resultados OTA unida a las partículas fue desorbida y medida directamente en una solución ácida según la siguiente reacción: Se estudió el comportamiento electroquímico de OTA (Figura 2). Figura 2. Voltamperograma cíclico de 0,5 mM de OTA en una solución de ácido perclórico 0,2 M como electrolito soporte (velocidad de barrido= 50 mV s-1, T = 25 ± 1 ºC)   La figura 2 muestra un voltamperograma de OTA, el cual exhibe un pico anódico a Epa= +1,25 V para el intervalo de potenciales de 0,7 a 1,4 V, correspondiente a la transferencia mono-electrónica de OTA. En cuanto al barrido en dirección inversa, no se observó ningún pico de reducción, mostrando que la oxidación de OTA en este medio de reacción es un proceso irreversible. Por otra lado, la diferencia entre la corriente debida a la muestra (en presencia de la OTA) y al blanco (línea punteada ) en ausencia de OTA) mostró una relación lineal con la cantidad de OTA en un intervalo de concentraciones determinadas. Por lo tanto, este método fue adecuado para la determinación de OTA en uvas utilizando VOCO por medida directa de su pico de oxidación. Con el fin de optimizar las condiciones de trabajo se evaluó el pH de desorción de OTA de las NPM modificadas, siendo el pH seleccionado 2.  Además, se evaluó la concentración de ácido perclórico en la etapa de cuantificación, siendo la concentración seleccionada 0,2 M. Por último, se estudió como influía la cantidad de NPM en la determinación, siendo la 260 μg la cantidad utilizada para los análisis. Para determinar el intervalo útil y la linealidad del método de VOCO se realizaron análisis de diferentes concentraciones de la mezcla de la solución estándar conteniendo 0,3-30 ppb. Se obtuvo una curva de calibrado, descripta por la siguiente ecuación: ΔI = 199,58 + 0,09C, con un coeficiente de correlación, r = 0,996. ΔI es la diferencia entre la corriente del blanco y la de la muestra (nA) y C es la concentración de OTA en la solución muestra en ppb. El límite de detección fue de 0,2 ppb. El sistema fue comparado con un ensayo espectrofotométrico comercial para la determinación de OTA, con una pendiente cercana a la unidad indicando una buena correlación entre ambos métodos.   Conclusión La técnica voltamétrica desarrollada combinada con el uso de NPM modificadas resultó ser adecuada para la determinación de OTA en muestras de uvas de vino. Dicho método, presenta: bajo costo, amplio rango lineal, reproducibilidad, precisión y un bajo límite de detección.   Referencias (1) Krogh P., Mycotoxins in Food, Academic Press, London, 1987. (2) Miller J.D., Trenholm H.L., Mycotoxins in Grain. Compounds other than Aflatoxin, Eagan Press, St. Paul, USA, 1994. (3) Goodman T.K., in: Miraglia M., Van Edmond H., Brera C., Gilbert J. (Eds.), Mycotoxins and phycotoxins—developments in chemistry, toxicology and food safety. alaken Inc., Fort Collins, USA, 1998, p. 25. (4) Zimmerli B., Dick R., Ochratoxin A in table wine and grape-juice: occurrence and risk assessment, Food Addit. Contam. 13 (1996) 655–668. (5) Rizzo A., Eskola M., Atroshi F., Eur. J. Plant Pathol. 108 (2002) 631. (6) M.H. Taniwaki, J.I. Pitt, A.A. Teixeira, B.T. Iamanaka, Int. J. Food Microbiol. 82 (2003) 173. (7) T. Vrabcheva, M. Gareis, H. Bresch, C. Bedectel, G. Engel, P. Majerus, H. Rosner, J. Wolff, Revue de Médecine Vétérinaire 149 (1998) 533. (8) P. Battilani, A. Pietri, Eur. J. Plant Pathol. 108 (2002) 639., A. Visconti, M. Pascale, G. Centonze, J. Chromatogr. A 864 (1999) 89. (9) Turner N.W., Piletska E.V., Karim K., Whitcombe M., Malecha M., Magan N., Baggiani C., Piletsky S.A., Effect of the solvent on recognition properties of molecularly imprinted polymer specific for ochratoxin A, Biosensors and Bioelectronics 20 (2004) 1060-1067. (10) Pittet, A., 2005. Mitt. Lebensm. Hyg. 96, 424–444. (11) Yu, F.-Y., Chi, T.-F., Liu, B.-H., Su, C.-C., 2005. J. Agric. Food Chem. 53, 6947–6953. (12) Alarcon, S. H., Micheli, L., Palleschi, G., Compagnone, D., 2004. Development of an electrochemical immunosensor for ochratoxin A. Analytical Letters 37, 1545-1558. (13) Alarcon, S.H., Palleschi, G., Compagnone, D., Pascale, M., Visconti, A., Barna- Vetro, I., 2006. Monoclonal antibody based electrochemical immunosensor for the determination of ochratoxin A in wheat. Talanta 69, 1031-1037. (14) Kaushik, A., Solanki, P.R., Ansari, A.A., Ahmad, S., Malhotra, B.D., 2008. Chitosan-iron oxide nanobiocomposite based immunosensor for ochratoxin-A. Electrochemistry Communications 10, 1364-1368. (15) F. Valentini, D. Compagnone, G. Giraudi, G. Palleschi, Anal. Chim. Acta 487 (2003) 83–90. (16) S.H. Huang, M.H. Liao, D.H. Chen, Direct binding and characterization of lipase onto magnetic nanoparticles, Biotechnol. Prog. 19 (2003) 1095–1100.