“Determinación de Anticuerpos IgG anti-gliadina Empleando un Sistema Inmuno-microfluídico Aplicado al Diagnóstico Automatizado de la Enfermedad Celiaca”

SIRLEY V. PEREIRA; MARCO A. SEIA; NOELIA A. MARTÍNEZ; DANIEL M.G. REGIART; JULIO RABA; GERMÁN A. MESSINA

Lanús, Pcia de Buenos Aires-Argentina

Congreso; XXVIII Congreso Argentino de Química y 4to. Workshop de Química Medicinal; 2010

Asociación de Química Argentina

DETERMINACION DE ANTICUERPOS IgG ANTI-GLIADINA EMPLEANDO UN SISTEMA INMUNO-MICROFLUIDICO APLICADO AL DIAGNOSTICO AUTOMATIZADO DE LA ENFERMEDAD CELIACASirley V. Pereira, Marco A. Seia, Noelia A. Martínez, Daniel M.G. Regiart, Julio Raba, Germán A. Messina.INQUISAL, Departamento de Química. Universidad Nacional de San Luis, CONICET. Chacabuco 917. D5700BWS. San Luis, Argentina.E-mail: messina@unsl.edu.arINTRODUCCIONLa enfermedad Celíaca (EC) es una enfermedad autoinmune generada por proteinas del gluten de ciertos tipos de cereales, las cuales afectan el intestino delgado de individuos genéticamente susceptibles. Se estima que alrededor de una de cada 250 personas padece esta enfermedad [1], la cual se caracteriza por inflamación intestinal, atrofia de las vellosidades intestinales e hiperplasia críptica [2].El diagnóstico de EC, se basa fundamentalmente en la endoscopia con biopsia y en técnicas serológicas que detectan la presencia de anticuerpos anti-gliadina, anti-endomisio y anti-transglutaminasa [3]. La determinación de autoanticuerpos se lleva a cabo empleando enzimo-inmunoanálisis (EIA) en muestras de suero humano, estos ensayos sientan las bases para el diagnóstico de EC en estadios tempranos de la enfermedad [4,5]. Corrientemente, EIA se lleva a cabo en policubetas, requiriendo varias etapas de intensa labor, largos periodos de incubación y múltiples lavados e incubaciones [6]. Alternativamente, los sistemas microfluídicos ofrecen numerosas ventajas con respecto a la escala convencional en la cual se desarrollan los inmunoensayos, debido a: disminución de los tiempos de análisis y del consumo de reactivos y muestras, incremento de sensibilidad a través de la automatización e integración de múltiples procesos en un único dispositivo [7].El presente trabajo describe el desarrollo de un inmunosensor microfluídico acoplado a detección electroquímica, aplicado a la determinación de anticuerpos IgG anti-gliadina en muestras de suero humano.METODOLOGIADiseñoLa figura 1 presenta un esquema general del dispositivo microfluídico construido de Plexiglás, donde se muestran los canales accesorios y de limpieza, el canal central (CC), conteniendo vidrio de porosidad controlada 3-aminopropilo modificado (AP-CPG)y el electrodo de lámina de oro que forma parte del sistema de detección y se ubica en la zona anterior a la salida del CC.Determinación de anticuerpos IgG anti-gliadinaPara la determinación de los anticuerpos de interés se procedió a la inmovilización de gliadina sobre la superficie de AP-CPG, que posteriormente fue inyectado en el CC del dispositivo. Seguidamente los anticuerpos IgG anti-gliadina fueron determinados mediante la utilización de un enzimo-inmunoanálisis heterogéneo no-competitivo en el cual los anticuerpos presentes en muestras de suero humano reaccionaron inmunológicamente con gliadina inmovilizada sobre AP-CPG. Posteriormente dichos anticuerpos fueron cuantificados a través de un anticuerpo secundario especifico anti-IgG humana unido a la enzima fosfatasa alcalina (FAL) que reacciona con el sustrato p-aminofenilfosfato (pAPP) liberando p-aminofenol (pAP) (Esquema 1), la oxidación de este producto electroactivo se detectó sobre un electrodo de oro a 0,250V. La corriente obtenida por oxidación del producto de la reacción enzimática es proporcional a la actividad de la enzima y consecuentemente a la concentración de anticuerpos IgG anti-gliadina presentes en la muestra.RESULTADOSDiferentes parámetros fueron estudiados para el óptimo desempeño del inmunosensor bioanalítico propuesto.Se llevó a cabo un análisis de la velocidad de flujo óptima, para lo cual se evaluaron las corrientes obtenidas para un estándar de 100 UR mL−1 a diferentes velocidades de flujo en un rango de1-15 μL min−1, la velocidad óptima resultante fue de 2 μL min−1.Del mismo modo se evaluó el volumen de muestra, usando un estándar de 100 UR mL−1, en un rango de 1–25 μL. La respuesta se incrementó linealmente y la sensibilidad se cuadruplicó para el caso de volúmenes de muestra entre 1-10 μL. Consecuentemente el volumen de muestra empleado fue de f 10 μL.Para el método propuesto se obtuvo una curva de calibración para la detección de anticuerpos IgG anti-gliadina en muestras de suero, en un rango de 0-200 UR mL−1. LaFigura 1.Representación esquemática del inmunosensor. CPG vidrio de porosidad controlada, WE electrodo de trabajo, CLC canal de limpieza, CC canal central.Esquema 1. Representación esquemática de la reacción inmune. CPG vidrio de porosidad controlada, FAL fosfatasa alcalina, pAPP p-aminofenilfosfato, pAP p-aminofenol. QI p-benzoquinona imina, GE electrodo de oro.ecuación de regresión lineal fue i(nA)=1,38+5.04 CanticuerposIgG, con un coeficiente de regresión lineal r=0.999. El coeficiente de variación (CV) para la determinación de 100 UR mL−1 de anticuerpos IgG anti-gliadina fue menor del 3,6 % (n=6). El límite de detección (DL) fue 0.52 UR mL−1.El sistema electroquímico fue comparado con un sistema espectrofotométrico comercial para la cuantificación de anticuerpos IgG anti-gliadina en 22 muestras de suero humano. La pendiente obtenida fue cercana a 1, indicando una buena correspondencia entre los dos métodos. Comparado con el EIA, el método propuesto mostró un gran incremento de sensibilidad.CONCLUSIONESEn este trabajo, se desarrolló un inmunosensor microfluídico acoplado a detección electroquímica, para cuantificar anticuerpos IgG anti-gliadina en forma rápida y selectiva en suero de pacientes que padecen enfermedad celíaca.El uso de AP-CPG como soporte sólido incrementa la superficie y consecuentemente la sensibilidad. Otros beneficios aportados por el sensor fueron: rápidos tiempos de análisis (29 min), menor consumo de muestra y reactivos respecto al inmunoensayo convencional. Por lo antes mencionado este inmunosensor microfluídico representa una herramienta extremadamente útil para brindar un diagnóstico rápido, sensible y automatizado de la enfermedad celíaca.Referencias[1] Collin P, Reunala T, Mäki M (1997) In: Mäki M, Collin P, Visakorpi JK (eds) Coeliac Disease: New diagnostic strategy for coeliac disease Proceedings of the Seventh International Symposium on Coeliac Disease, Vammalan kirjapaino Oy, Vammala.[2] Shewry PR, Tatham AS (1999) In: Shewry PR, Casey R (eds) Seed proteins. Kluwer, Dorfrecht.[3] Schulzke J-D, Tröger H, Amasheh M (2009) Best Practice & Research Clinical Gastroenterology 23:395–406.[4] Rijal K, Leung A, Mohana Shankar P, Mutharasan R (2005) Biosens Bioelectron 21:871–880.[5] Li M, Lin YC, Su KC, Wang YT, Chang TC, Lin HP (2006) Sens Actuators B 117:451–456.[6] Abdel-Hamid I, Atanasov P, Ghindilis AL, Wilkins E (1998) Sens Actuators B 49:202–210.[7] Bange A, Halsall BH, Heineman WR (2005) Biosens Bioelectron 20:2488–2503.