Caracterización molecular de las etapas tardías de fusión de membranas durante la reacción acrosomal. Mapeo de componentes e interrelación entre vías.

BRANHAM MT; BUSTOS MA; RODRIGUEZ JF; RUETE MC; ZARELLI VE; TOMES CN

Mendoza

Jornada; XXII Jornadas de Investigación, VI Jornadas de Posgrado, Universidad Nacional de Cuyo; 2010

El espermatozoide sufre un tipo especial de exocitosis regulada por calcio (la reacción acrosomal, RA) que es un prerequisito esencial para la fertilización del ovocito. La RA requiere un ingreso de calcio del medio extracelular, síntesis de cAMP, el ensamblado de la maquinaria proteica de fusión y la movilización de calcio de reservorios sensibles al IP3. La ausencia de transcripción y traducción por parte de los espermatozoides limita los abordajes accesibles para el estudio de los mecanismos moleculares que gobiernan la RA. Para superar esta limitación, nuestro laboratorio ha desarrollado un método de permeabilización controlada de la membrana plasmática con estreptolisina O (SLO). Así, podemos hacer uso de herramientas bioquímicas y de biología molecular, fundamentalmente introduciendo en las células iones o proteínas exógenas, tales como anticuerpos y neurotoxinas, que por lo general son incapaces de penetrar la membrana y pueden ser utilizadas para identificar la función de la molécula blanco endógena. Gracias a este protocolo, hemos demostrado que la RA utiliza la misma maquinaria exocítica que las neuronas y células neuroendócrinas: Rab3A, SNAREs, "-SNAP, NSF, sinaptotagmina, calmodulina, complexina y por supuesto, calcio, particularmente aquel almacenado dentro del acrosoma y liberado al inducirse la RA. En concordancia con el resto del campo, el foco de interés de mi laboratorio ha ido cambiando gradualmente desde la identificación y caracterización de los componentes de la maquinaria de fusión al estudio detallado de cómo funcionan estos componentes de manera concertada para lograr la exocitosis. En nuestro modelo actual proponemos que al estimular el sistema se inicia una cascada de eventos que incluye la producción de cAMP por una adenilato ciclasa soluble; el blanco de cAMP relevante para la RA es la proteína Epac. Epac se ubica en un punto central de la cascada a partir del cual ésta se divide en dos ramas: una que se inicia al activarse Rap1 y culmina en la movilización de calcio del acrosoma y otra que se inicia al activarse Rab3A y que ensambla la maquinaria proteica de fusión; ambas son requeridas para la RA. La rama en la que participa Rab3A incluye el desensamble de complejos cis SNAREs (improductivos para la fusión y presentes en las membrana plasmática y acrosomal externa) por NSF/"-SNAP. La actividad de NSF está reprimida por fosforilación en tirosina en espermatozoides en reposo; la iniciación de la RA activa a la PTP1B, quien defosforila y activa al NSF. Las SNARE monoméricas, asistidas por complexina y Munc18, se ensamblan en complejos trans (verdaderos puentes moleculares entre las membranas que van a fusionarse). En este punto ambas ramas convergen, el calcio movilizado del acrosoma activa a la sinaptotagmina y el proceso culmina con la apertura de los poros de fusión.