Caracterización de una mutante nula en la proteasa romboide RhoII en la haloarquea Haloferax volcanii.

FERRARI, M.C.; DE CASTRO R.E.; GIMÉNEZ M.I.

Mar del Plata

Encuentro; VIII Encuentro Anual de Biólogos en Red; 2013

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad Nacional de Mar del Plata

Las proteasas romboides constituyen una familia de serín proteasas intramembrana, que se encuentran conservadas en los tres Dominios de la vida. Están ampliamente representadas en los genomas de arqueas, aunque la función de estas enzimas en este grupo de organismos es desconocida. Las haloarqueas codifican para dos o más homólogos de proteasas romboides, incluyendo un grupo conservado que posee un dominio Zn-finger de tipo AN-1 en el extremo N- terminal precediendo al dominio romboide y 6 segmentos transmembrana. El genoma de la haloarquea Haloferax volcanii presenta dos loci que codifican para posibles proteasas romboides denominadas RhoI y RhoII, siendo RhoII el homólogo con el motivo Zn-finger. El gen rhoII se encuentra en una unidad transcripcional con endV, el cual codifica para una endonucleasa de tipoV. En nuestro laboratorio se construyó una mutante nula por eliminación del gen rhoII en H. volcanii (MIG1), sugiriendo que su producto no es esencial para la viabilidad de esta arquea. Sin embargo, la mutante MIG presentó diferencias en la morfología celular, movilidad en placas de agar blando, sensibilidad al antibiótico novobiocina y recuperación luego de la irradiación con luz UV, en comparación con la cepa parental (H26). Por otra parte, se encontraron diferencias en el patrón electroforético de proteínas glicosiladas y el análisis de la porción glicosídica de una de estas glicoproteínas (proteína de la capa S) demostró que la mutante posee un oligosacárido en la posición N573 de menor tamaño con respecto al unido en H26 en la misma posición. Para atribuir estos fenotipos a la ausencia de rhoII, resulta necesario revertirlos complementando la mutante con una copia del gen salvaje expresada desde un vector apropiado. La complementación de MIG1 con un plásmido conteniendo rhoII bajo el control de promotores heterólogos de haloarqueas no fue exitosa, ya que no se pudo detectar expresión de RhoII (a nivel de ARNm y/o proteína). Con el fin de mejorar la expresión de RhoII, se generó una construcción incluyendo el operón completo con sus regiones promotoras y reguladoras, la cual fue clonada en un plásmido para su expresión en H. volcanii. Esta construcción fue introducida en la mutante MIG1. Los fenotipos de sensibilidad frente a novobiocina y movilidad fueron revertidos significativamente en la cepa complementada, indicando que los mismos se deben efectivamente a la ausencia de rhoII. Este trabajo constituye el primer estudio que aporta información sobre la función de las proteasas romboides en el Dominio Archaea.