Rol de la apolipoproteína A-I, CD36 y receptores tipo Toll en el control del perfil inflamatorio

MAXIMILIANO JIMÉNEZ DALMARONI; DÍAZ LUDOVICO IVO; BECERRA ROMINA; GONZALEZ MARINA CECILIA (SENIOR AUTHOR)

La Plata

Jornada; Jornadas de Investigación de la Facultad de Cs. Médicas de la UNLP; 2023

Facultad de Cs. Médicas, UNLP.

Introducción: Niveles de citoquinas pro-inflamatorias han sido descriptas como factores negativos en la prognosis, morbilidad y mortalidad en pacientes con enfermedades cardiovasculares. De esta manera, un ambiente pro-inflamatorio favorece la polarización de macrófagos a células espumosas o “foam cells”, contribuyendo a la formación de placas aterogénicas. En este contexto, diferentes proteínas de la respuesta inmune innata y del metabolismo del colesterol han sido involucradas. La apolipoproteína A-I (apoA-I) es el principal componente proteico de las HDLs, con un rol central en el transporte del colesterol desde tejidos periféricos hacia el hígado, llamado transporte reverso del colesterol (TRC). La apoA-I “wild type”, ha sido descripta con capacidad anti-inflamatoria mientras que mutaciones de la misma tienen características pro/anti-inflammatorias. Estudios recientes del grupo indican una asociación anti-inflamatoria de apoA-I mediada por el sistema Nrf2/keap1. También, receptores de tipo toll (Toll-like receptors o TLRs) son los principales receptores del sistema immune innato. TLRs reconocen estructuras microbianas (PAMPs) y del huésped (DAMPs) y generan una cascada de senalización que desencadena la secreción de citoquinas pro-inflamatorias y moléculas co-estimuladoras que favorecen la maduración y activación de células B y macrófagos. El receptor de lipoproteínas de baja densidad oxidadas (LDLox) llamado CD36 ha sido descripto como un co-receptor de TLR2 y TLR4. Objetivos:Investigar el rol de CD36 en la activación de TLR2Estudiar la actividad anti-inflamatoria de apoA-I wild type mediada por el sistema Nrf2/keap1Materiales y métodos:El ectodominio murino de CD36 (mCD36) fue expresado de manera recombinante empleando el sistema baculovirus/celulas de insecto Hi-5 y el mCD36 fue purificado del sobrenadante por cromatografia de intercambio iónico y de exclusión molecular. Macrófagos peritoneales fueron extraídos a los 3 días posteriores de una inyección intraperitoneal de tioglicolato. Los macrófagos fueron incubados por 4 horas con diferentes concentraciones de ligandos microbianos o diferentes concentraciones de ácido lipoteicoico (LTA) y cantidades constantes del ectodominio murino de CD36 (mCD36) (50-100 ng /ml) o 100 ng/ml de mCD36 fue desnaturalizado por calor. Los valores del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) secretados del sobrenadante fueron determinados por ensayo citotoxico L929. ApoA-I wild type fue purificada de E. Coli por IMAC. Macrófagos Thp1 fueron crecidos hasta confluencia en RPMI +10%SFB. Los extractos fueron obtenidos usando RIPA. Las proteínas fueron reducidas por DTT y oxidadas por iodoacetamida. Las muestras fueron analizadas por LC-MS en un Quadrupolo-Orbitrap luego de la separación por HPLC fase reversa. Una combinación de Protein discoverer, MaxQuant y Perseus fueron usados para determinar diferencias en la expresión proteica. Los resultados fueron validados por western blot usando anticuerpos específicos. Las proteínas fueron determinadas por el Image J y normalizadas por β-Actin.Resultados:- La secreción de citoquina pro-inflammatoria TNF-α por ligandos bacterianos (lipomanan de mycobacteria smegmatis, FSL-1 de micoplasma, y LTA de S. aureus) es dependiente de TLR2, CD36, and CD14.- El mCD36ED amplifica la respuesta pro-inflamatoria a LTA en macrófagos, y recupera la respuesta a LTA en macrófagos deficientes de CD36 a niveles basales pero no así la respuesta de macrófagos deficientes en CD14.- ApoA-I incrementa niveles de P62 y este activa Nrf2 por un mecanismo no canónico.Conclusiones:Basados en nuestros resultados proponemos un modelo en el que CD36 une los ligandos microbianos derivados de diacilglicerol, los transfiere a CD14, y luego estos son transferidos a TLR2/TLR6 (FSL-1, LTA), o TLR2/TLR1 (lipomanan) activando la secreción de citoquinas pro-inflamatorias.El tratamiento de apoA-I en macrófagos THP1 causa un incremento de P62 y activa un sistema de señalización intracelular no canónico mediado por Nrf2. Dichos resultados son prometedores para develar el mecanismo anti-inflamatorio activado por apoA-I.