Obtención de proteínas entomotóxicas recombinantes en Bacillus thuringiensis.

BERÓN, C.M.; SALERNO, G

Córdoba, Argentina

Congreso; XI Congreso Argentino de Microbiologia; 2007

Asociacion Argentina de Microbiología

Una de las alternativas más promisorias al uso de insecticidas químicos es el empleo de microorganismos entomopatogénos en el control de insectos dañinos. Entre ellos, la bacteria Gram + Bacillus thuringiensis posee un importante efecto insecticida presentando una alta especificidad contra insectos susceptibles pertenecientes a diversos ordenes. Este bacilo produce durante el proceso de esporulación un cristal formado por una o más proteínas insecticidas (toxinas Cry y Cyt). La aplicación de B. thuringiensis como bioinsecticida se realiza principalmente como formulado a base de complejo espora-cristal o como organismos genéticamente modificados capaces de expresar estas toxinas. El desarrollo de nuevos formulados es un desafío constante en el control de plagas, sin embargo la producción de toxinas Cry en un sistema heterólogo como Escherichia coli no resulta eficiente ni adecuado. Muchos plásmidos pequeños originados por bacterias Gram + se replican por medio del mecanismo del circulo rodante, y son frecuentemente inestables estructuralmente cuando son usados como vectores de clonado. Por lo tanto, la construcción de vectores de expresión que contengan regiones de replicación provenientes de plásmidos residentes estables de B. thuringiensis resulta ventajosa. Por otro lado, la posibilidad de introducir genes codificantes de entomotoxinas dentro de cepas de B. thuringiensis permite la expresión de proteínas Cry en forma individual y de esa manera confirmar su actividad entomopatógena. El objetivo de este trabajo fue generar un sistema heterólogo de expresión de proteínas Cry en cepas acristalíferas de B. thuringiensis. Este trabajo fue desarrollado a partir de secuencias codificantes de toxinas Cry nativas, aisladas y caracterizadas previamente en nuestro laboratorio. Para la construcción del vector de expresión se utilizó el plásmido pHT315, derivado del plásmido pHT3103, caracterizado por su estabilidad segregacional en B. subtilis. En primer término tanto la secuencia correspondiente al promotor de la toxina Cyt1Aa de B. thuringiensis como las secuencias codificantes correspondientes a proteínas Cry nativas, fueron clonadas en el vector pGEM-T Easy, para posteriormente ser subclonadas en el plásmido pHT315. El vector de expresión desarrollado fue introducido en células de la cepa acristalífera 4Q7 de B. thuringiensis subespecie israelensis por medio de electroporación. Las mutantes portadoras de las secuencias codificantes de interés fueron obtenidas en forma axénica después de ser seleccionadas por medio de su cultivo en medios de cultivo adecuados (LB) en presencia de antibióticos específicos (ampicilina y eritromicina). En este trabajo fue posible desarrollar mutantes de B. thuringiensis portadoras de toxinas Cry nativas como un sistema de expresión heteróloga segura que permitirá en el futuro la obtención de productos formulados comerciales de alta eficiencia en el control de insectos plaga de importancia económica.