Identificación molecular de cianobacterias presentes en una floración en el embalse Yacyretá, Argentina-Paraguay

LLANO, V.; BERÓN, C.; MEICTHRY DE ZABURLIN, N.; SALERNO, G.

Mar del Plata, Argentina

Workshop; Cianobacterias Toxígenas en el Conosur Búsqueda de Estrategias Multidisciplinarias para Determinar sus Alcances e Impactos, y Desarrollar Medidas de Prevención y Manejo de sus Riesgos.; 2005

FIBA-APCYT

En los últimos años se ha observado un aumento en la aparición de floraciones cianobacterianas en distintos sistemas fluviales del país. En las represas, ambientes lénticos creados artificialmente, estos fenómenos son frecuentes. El cierre de la presa Yacyretá y el llenado del lago, en agosto de 1994, produjo la reducción del flujo y el aumento del tiempo de residencia del agua en el embalse, estos factores provocaron cambios en la composición y densidad de la comunidad fitoplanctónica y un aumento en la frecuencia de aparición de proliferaciones de cianobacterias. Durante el verano de 2005 se registró una floración de Microcystis aeruginosa en la margen izquierda del embalse, en la zona de Puerto Valle (27° 36´S 56° 25´O). Con el objeto de identificar molecularmente las especies presentes en la floración se colectaron muestras de la espuma superficial. A partir de ADN total extraído de una alícuota de estas muestras, se realizó la amplificación de la secuencia de la región PC-ING (región intergénica del operón ficocianina), por medio de la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), usando los iniciadores PCbF/PCaR. Los productos de amplificación obtenidos fueron analizados por electroforesis en geles de agarosa (1%), logrando detectar un único producto de amplificación de aproximadamente 600 pb. Posteriormente estos fragmentos de ADN fueron clonados en el vector pGEM-T Easy e introducidos en células competentes de la cepa DH5a de Escherichia coli. Para verificar la correcta inserción del fragmento de interés se realizó la purificación del plásmido recombinante a partir de 42 colonias transformantes. Luego se realizó la digestión del ADN plasmídico con la enzima de restricción EcoR1 para liberar los fragmentos insertados, confirmando la presencia de 17 colonias positivas. Para identificar qué especies de cianobacterias estaban presentes en las muestras de Puerto Valle, se determinó el patrón de restricción de los insertos liberados por medio de la digestión con la enzima HaeIII. De esta manera fueron determinados dos patrones de restricción diferentes, lo que sugería que podría tratarse de dos microorganismos distintos. Se realizó la purificación y secuenciación de ADN plasmídico a partir de cultivos de 5 colonias de E. coli que presentaron estos dos tipos de patrones de restricción. La identidad de los fragmentos correspondientes a las regiones intergénicas del operón ficocianina de los 5 clones seleccionados fue determinada por medio del análisis de sus secuencias en el programa BLASTn, lográndose identificar las cepas de cianobacterias: Microcystis sp. KLL MB-K (AY524848) y Microcystis aeruginosa UWOCC (AF195159). A partir de estas secuencias se hicieron análisis de alineamientos múltiples con datos presentes en bases públicas y se generaron dendrogramas y como resultado de ello surgió que estos organismos están agrupados en dos clados diferentes. Por otro lado se determinó la presencia de diversas especies procariotas en las muestras de la misma floración por medio de la metodología de “denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)”. Para ello, la muestra a analizar fue filtrada a través de una malla de 35 µm (fracción G1) y el líquido remanente fue nuevamente filtrado por una malla de 22 µm (fracción G2). A partir de ADN extraído de ambas muestras ambientales se realizó la amplificación de una secuencia interna variable de los genes ribosomales 16S por medio de la técnica de PCR, utilizando los iniciadores 907R/GC358F, obteniéndose como producto de la amplificación un fragmento de aproximadamente 550 pb determinado por medio de electroforesis en geles de agarosa. Posteriormente, los fragmentos fueron separados electroforéticamente por la metodología de DGGE. Como resultado de este análisis se pudo observar la presencia de productos de amplificación que corresponden a distintas especies presentes en la floración. Por otra parte, los resultados preliminares obtenidos con la metodología de DGGE, muestran que se podrá realizar un seguimiento molecular de las especies que constituyen una floración, por medio de la identificación por secuenciación de los productos de amplificación resultantes.