Identificación molecular y aislamiento en cultivo de componentes del picofitoplancton eucariota en el mar Argentino

CUMINO, A.; SILVA, R.; NEGRI, R.; BERÓN, C.; SALERNO G.L.

Viña del Mar, Chile

Congreso; XI Congreso Latinoamericano de Ciencias del Mar.; 2005

A partir del descubrimiento de los componentes más pequeños del fitoplancton (picofitoplancton, < 2 µm) a fines de los años ’70 (Waterbury et al., 1979), se comenzó a evaluar el aporte de las fracciones más pequeñas a la biomasa y producción primaria, alcanzando en algunas áreas valores de hasta el 90 % tanto en aguas oligotróficas como en costeras (Li et al., 1994; Vaquer et al 1996). Recientemente, con la aplicación de técnicas moleculares, se ha descubierto una importante diversidad en los componentes eucariotas de esta fracción. Entre éstos, se destacan los pertenecientes a las clases Prasinophyceae, Pelagophyceae y Prymnesiophyceae (Moon-van der Staay et al., 2001). La mayor parte de estos estudios se han realizado en aguas oceánicas y costeras del hemisferio norte, siendo muy escasa la información referida al hemisferio sur en general y particularmente en el Mar Argentino. En este trabajo, se presentan los primeros resultados de la caracterización molecular de especies de las fracciones más pequeñas del fitoplancton en cultivos unialgales y en muestras ambientales en aguas costeras de la provincia de Buenos Aires (Argentina). Las muestras consideradas en este estudio forma parte de un proyecto mayor relativo al estudio de la dinámica del plancton marino en una serie de tiempo en la estación EPEA (Estación Permanente de Estudios Ambientales - 38º28’S-57º41’W). Esta estación está localizada en las proximidades de la isobata de 50 m, en un área de transición entre aguas costeras y aguas de plataforma media (Guerrero & Piola, 1997). En cada campaña se registró el perfil de temperatura y salinidad utilizando un CTD (SeaBird SBE 19) y se colectaron muestras de agua a 5 profundidades utilizando botellas tipo Niskin. A partir de estas muestras se determinó la concentración de clorofila a total y la correspondiente a la fracción menor de 5 µm. Para determinar la estructura de la comunidad picofitoplanctónica, se utilizaron muestras de agua correspondientes a 5 m de profundidad. De éstas, 50 ml fueron fijados con formaldehído (concentración final 0,2%) y filtrados a través de una membrana negra de policarbonato de 0.2 µm de poro las que se almacenaron a –20ºC hasta su análisis posterior en el laboratorio. Las células se cuantificaron por microscopia de epifluorescencia y análisis de imágenes (Maclsaac y Stockner, 1993). A partir de los valores de las concentraciones y dimensiones celulares, se realizó la estimación de la biomasa (µg C l-1). Para la caracterización molecular de ADN ambiental se filtraron tres litros de agua a través de membranas de policarbonato de 5 µm de poro con el fin de eliminar los componentes mayores del fitoplancton y posteriormente, el filtrado resultante, a través de membranas de 0,2 µm de poro para retener la fracción a analizar. Estos filtros conservados con tampón de lisis en nitrógeno líquido, fueron utilizados para posterior extracción de ADN. Simultáneamente se obtuvieron cultivos unialgales utilizando medio de cultivo F/2 (sin silicatos) y conservados a temperatura controlada con un ciclo de 12/12 h luz/oscuridad. Se extrajo ADN total a partir de las muestras ambientales y de cultivos según protocolos previamente descriptos (Schauer et al. 2003).  Se caracterizaron especies eucariotas fitoplanctónicas, mediante amplificación de ADNr por metodología basada en la PCR usando oligonucleótidos universales para cada grupo (Diez et al., 2001). Los fragmentos de ADN amplificados fueron separados por electroforesis en geles de agarosa (1 %) y aquellos de tamaño esperado (aproximadamente 1790 pba para genes 18S) fueron purificados y clonados en el vector pGEM-T Easy (Sambrook & Russell, 2001). Se transformaron células competentes de Escherichia coli cepa DH5 a según protocolos estándar. Las colonias positivas fueron transferidas y crecidas en placas multipozos estériles, conteniendo medio Luria-Bertani y 7% de glicerol. La presencia de insertos correspondientes a los genes 18S fue confirmada por reamplificación por PCR con los mismos oligonucléotidos. Los productos de PCR obtenidos durante el análisis de clones positivos, fueron  digeridos con la enzima de restricción HaeIII (Promega) y separados mediante electroforesis en 2,5% agarosa (Low melting, SIGMA) resultando diferentes patrones de RFLP (restriction fragment length polymorphism). Los clones de rADN con idéntico patrón electroforético fueron considerados miembros de la misma OTU (unidad taxonómica operacional). Se purificaron y se secuenciaron aquellos plásmidos que provinieron de diferentes OTUs haciendo uso de prestación de servicios externos (Macrogen, Corea). Se analizaron las secuencias obtenidas mediante BLAST (Altshul et al. 1990) y posteriormente se realizarán alineamientos múltiples de secuencias utilizando el programa CLUSTAL X (Thompson et al. 1997). Para este estudio, considerando el aporte de esta fracción a la biomasa total, tanto por la concentración de clorofila < de 5 µm como por la abundancia, se seleccionaron muestras de dos campañas correspondientes a los meses de febrero de 2002 (CC0302) y mayo de 2004 (CC0804), de las que se iniciaron cultivos unialgales. Las campañas consideradas representan dos condiciones hidrográficas bien diferentes. La correspondiente al mes de febrero, con la columna de agua estratificada, presentó valores de temperatura que oscilaron entre 20,82ºC y 16,53ºC para superficie y fondo respectivamente, y de salinidad entre 33,72 y 33,65 ups para las mismas profundidades. Por el contrario, la campaña de mayo, presentó la columna de agua completamente homogénea con valores de temperatura y salinidad de 15,11-15,10ºC, y 33,94-33,98 ups correspondientes también a superficie y fondo. Con respecto a la biomasa fitoplanctónica (considerada como concentración de clorofila a), la fracción menor de 5 µm representó en febrero entre 23 y 68%, mientras que en mayo los valores oscilaron entre 18 y 44% de la clorofila total. Del análisis microscópico de las muestras se identificaron cianobacterias del tipo Synechococcus, y entre los eucariotas, las formas dominantes correspondieron a células cocales de aproximadamente 2 µm de diámetro. Estas picoeucariotas, con biomasas de 5,15 µg C l-1 (febrero) y 4,28 µg C l-1 (mayo), representaron un 45% y 70,5% respectivamente, de la biomasa de esta fracción. A partir de la identificación por técnicas moleculares, el grupo de las prasinoficeas fue el dominante. Entre éstas se destacó el predominio de una cepa aislada tanto de muestras ambientales como de cultivos de laboratorio. Esta cepa representó el 40% de los clones identificados a partir de datos preliminares de una minilibrería genómica de SSU ADN ribosomal correpondiente al mes de mayo del año 2004 y mostró un 98-96 % de homología con secuencias de ADNr de la cepa ambiental RA001219.46 y del cultivo RCC 287 respectivamente. Esta cepas pertenecen al nuevo grupo taxonómico recientemente descrito de prasinofitas denominado Clade VII (Lewin et al., 2000; Guillou et al., 2004). Las herramientas moleculares basadas en la amplificación y secuenciación de genes provee una poderosa herramienta para analizar la diversidad de las fracciones más pequeñas del plancton. Recientes trabajos basados en la identificación de genes de ADN ribosomal revelan el gran número de prasinofitas en muestras oceánicas y costeras (Guillou et al., 2004; Romari & Vaulot, 2004). Si bien nuestros resultados están de acuerdo con lo señalado por estos autores, se destaca el predominio de una cepa correspondiente al clade VII de prasinofitas, la cual fue aislada tanto en cultivos como en muestras ambientales, y puede constituir un interesante modelo para el estudio filogenético de este nuevo linaje picofitoplanctónico. Esta cepa, aislada en dos épocas del año bien diferentes, parece ser un componente conspicuo del picofitoplancton en aguas costeras bonaerenses, contribuyendo significativamente a la biomasa fitoplanctónica.