Contribución al Estudio de Nemátodos y Nematomorfos Parásitos de Insectos. Situación Actual del Conocimiento. Laboratorio de Entomonemátodos

CAMINO, N.B.; DE VILLALOBOS, C; ZANCA, F; ACHINELLY, M. F; MICIELI, M. V; GHIRINGHELLI, P. D; BELAICH, M.N.; BULDAIN, DANIEL; ELICECHE,D.; SALAS, A.; RUSCONI, M.

Taller Argentino de Patología de Insectos y sus Aplicaciones en Biocontrol.

Universidad Nacional de Mar del Plata

Lugar: Mar del Plata; Año: 2013; p. 21 - 29

El Centro de Estudios Parasitológicos y de Vectores, (CEPAVE), es un instituto creado hace 25 años en la Argentina, especializado en estudios sobre los patógenos de insectos de importancia económica y su uso en el control de especies de interés agrícola y sanitario. La utilización de enemigos naturales es una herramienta valiosa para el control de insectos perjudiciales, preferentemente en sistemas de producción hortícola y forestal, que puede evitar o reducir la contaminación creciente del aire, agua, suelo y alimentos con residuos de pesticidas sintéticos. El laboratorio de entomonemátodos, perteneciente a dicho instituto, ha acumulado una sólida formación en la temática. La meta del laboratorio entre otras, es aislar e identificar nemátodos, potenciales agentes para el control de insectos perjudiciales, eficaces, específicos y seguros para el ambiente, que puedan ser utilizados sólos o complementados con otros métodos de control. Los resultados han sido divulgados a través de publicaciones en revistas especializadas nacionales y extranjeras, y en muchos casos transferidos al sector privado y público en forma de asesoramientos técnicos y convenios de cooperación. Entre las contribuciones pueden citarse la descripción de numerosas especies (Poinar y Camino 1986, Camino 1987, 1991, Camino et al. 2000, 2001, 2002, 2004 y 2005), determinación de sus ciclos biológicos (Camino et al. 1993, 1997, 1998), ecología de especies patógenas (Camino y García 1988, 1991, 1992, Camino 1988, Camino et al. 1994, 1996, 2000, Achinelly y Camino, 2005), y dinámica en condiciones naturales (Micieli y García, 1999; Achinelly & Micieli, 2009; Micieli et al., 2012). Estudios tendientes a la optimización de la producción en el laboratorio se han desarrollado para nemátodos pertenecientes a la familia Mermithidae (Achinelly & Camino, 2005; Achinelly & Micieli, 2011), y actualmente Heterorhabditidae (Achinelly et al., 2011; Eliceche et al., 2011; 2012). Entre los principales nemátodos estudiados se encuentra el mermítido Strelkovimermis spiculatus, hallado por primera vez en el arroyo Miguelín, Punta Lara, Argentina (Poinar y Camino, 1986) en criaderos del mosquito de las inundaciones Ochlerotatus albifasciatus. Su ciclo biológico tiene una duración aproximada de 35 días siendo similar al de otros mermítidos acuáticos, aunque varió dependiendo de la temperatura (Camino y Reboredo, 1996). Los adultos colocan los huevos en el ambiente en el que se encuentran, lugar donde sucede el desarrollo embrionario con una duración aproximada de 8 días, a 20°C de temperatura (Camino y García, 1988). Posteriormente, el estado infectante (J2) sale del huevo y penetra activamente en la larva del mosquito hospedador utilizando un estilete y alojándose en el hemocele. Allí muda a J3 (estado parásito) y luego a J4, cuando abandona el hospedador; provocando inevitablememente su muerte. El mermítido Strelkovimermis spiculatus se adapta muy bien al ciclo de vida de sus hospedadores, tolera niveles elevados de salinidad y materia orgánica, (Camino y García , 1991; Achinelly et al. 2003; Micieli et al. 2013), un amplio rango de temperatura (Achinelly & García, 2003), y presenta una mayor tolerancia a permanecer latente por largos períodos de sequía del ambiente (Micieli et al. 2012). Estudio de la patogenicidad en especies susceptibles, y fauna acompañante demostraron su especificidad en larvas de mosquitos (Achinelly y Micieli, 2013) y no constituir un riesgo para otros organismos benéficos (Achinelly et al. 2004). Epizootias producidas por este nemátodo fueron observadas en poblaciones naturales del mosquito plaga O. albifasciatus (Campos y Sy, 2003, Micieli et al. 2012), en la provincia de Buenos Aires. Otras especies de mosquitos han sido registradas en estos ambientes cuando se han quedado inundados por un período de tiempo más prolongado de lo habitual, pero siempre en niveles enzoóticos (García et al, 1994a; Maciá et al, 1995, Achinelly y Micieli, 2013). Inclusive, poblaciones de este nemátodo presentaron variaciones en los valores de prevalencia en ambientes con similares características, cuyas causas se desconocen. Micieli et al., (2012), determinaron al estudiar la dinámica poblacional de S. spiculatus en sitios de cría temporarios de mosquitos tres comportamientos diferentes. Un primer ambiente ubicado en la localidad de Punta Lara (Partido de Ensenada) con una reducción de larvas de mosquitos del 80,7% debido a la presencia de este parásito, donde se infectaron 100% de las generaciones; una situación intermedia en otro sector de Punta Lara (un 41,9% de reducción) implicado un menor porcentaje de parasitismo por encima del 50%, aunque la infección por nemátodos se registró en el 92,9% de las nuevas generaciones. El tercer ambiente, ubicado en el barrio de Los Hornos (Localidad de La Plata), registró una reducción larval del 2,7%, donde sólo el 46,0% de las nuevas generaciones de mosquitos estaban parasitadas y en niveles de infección por debajo del 50%. En el mismo estudio el área de inundación fue la única variable significativa asociada con el porcentaje de infección, los cuales se correlacionaron positivamente con el número medio de nemátodos por larva surgido y con la proporción macho- hembra emergidos en cada generación de larvas de mosquito. El parasitismo por S. spiculatus en zanjas de desagües domiciliarios nunca alcanzó niveles epizoóticos, registrándose valores máximos de 0,17 % para el sitio de cría ubicado en la localidad de La Granja (García y Camino, 1990). Infecciones en laboratorio en agua proveniente de estos criaderos demostraron una prevalencia considerablemente inferior que en aguas provenientes de ambientes de inundación temporaria, y en los controles con agua corriente libre de cloro. En las infecciones se determinó una marcada reducción de los porcentajes de parasitismo en larvas de A. aegypti y C. pipiens, variando en las larvas de C. pipiens entre 89,3% (0% agua zanja) y 15,7% (100% agua de zanja) y entre 91,6% (0% agua zanja) y 5,0% (100% agua de zanja) en las larvas de A.aegypti, siendo del 92 % en los controles con agua proveniente de sitios de cría inundados a partir de las precipitaciones. La viabilidad de las formas infectivas en estos tipos de agua fue evaluada registrándose al transcurrir 48 hs de exposición en agua proveniente de las zanjas una supervivencia de 1% de las J2 respecto del 88% en los controles en agua corriente libre de cloro. La variabilidad observada en la viabilidad y capacidad infectiva de los preparásitos juveniles en diferentes tipos de agua, condujo a analizar sus características físico-químicas. Los resultados obtenidos, evidenciaron el alto nivel de fósforo y amonio en las zanjas de desagüe pluvio-domiciliario. El alto contenido de amonio (superior a los 0,5 mg/L) permitieron considerar a las aguas provenientes de las zanjas como químicamente contaminadas. El efecto de la concentración de amonio y fósforo, sobre la viabilidad de las J2, se estudió en el laboratorio y se determinó que para una dosis de 3 mg N/L, la prevalencia de S. spiculatus disminuyó a 76%, siendo 94% en los controles en agua corriente libres de cloro. Sin embargo cuando la concentración se elevó a 4 mg de N/L, el parasitismo se redujo considerablemente a 3%, registrándose una importante mortalidad de los estados preparásitos (Achinelly, 2004). Los valores obtenidos en zanjas de la localidad de Gonnet, en colectas realizadas durante los años 2011 y 2012, también mostraron valores de parasitismo enzoóticos, aunque en mayores niveles, que pudieron alcanzar el 50% (Muttis, com. Personal). Sin embargo, no se registraron hasta el momento datos sobre los parámetros físico-químicos del agua. Tales resultados justifican las diferencias observadas en los niveles de infección de S. spiculatus, registrados entre ambientes de cría de mosquitos de inundación permanentes y temporarios. Esto nos hace pensar sobre la existencia de diferentes características fisiológicas, físicas y/o de comportamiento, que podrían estar correlacionadas con variaciones a nivel genético entre las diferentes poblaciones del nemátodo S. spiculatus, especialmente en aquellas que habitan en zanjas de desagüe domiciliario, un ambiente inhóspito para el desarrollo del ciclo de estos nemátodos. Por este motivo se realizó un análisis genético donde se evaluaron secuencias parciales del gen ribosomal 18S, y de los genes mitocondriales cox1 y nd4, ya que se contaba con secuencias disponibles en el GenBank. Utilizando el ADN aislado como molde, se amplificaron las secuencias correspondientes al gen 18S, cox1 y nd4 por PCR. Los primers utilizados para amplificar el gen ribosomal se correspondieron a los descriptos en el trabajo de Kobylinski et al., (2012). Mientras que los primers utilizados para los genes mitocondriales fueron diseñados ad hoc en base a las secuencias depositadas en el GenBank (Buldain, 2013). De acuerdo a nuestros resultados, el gen 18S no funcionó como buen marcador para determinar variación, a diferencia de los genes mitocondriales que establecieron variaciones intraespecíficas entre poblaciones de nemátodos (Buldain, 2013). En el futuro se prevee analizar mayor cantidad de loci, particularmente cox1 diseñando nuevos primers y regiones ITS. La familia Heterorhabditidae consituye un grupo de nemátodos patógenos comunes en insectos, capaces de regular las poblaciones de sus hospedadores manteniéndolas debajo de los niveles de daño económico. El relevamiento de nemátodos parásitos de insectos en huertas de cultivo orgánico en la localidad de Villa Elisa, La Plata, reveló la presencia de un aislamiento del entomonemátodo Heterorhabditis bacteriophora a partir de muestras de suelo. Este constituye el primer registro para este grupo de nemátodos para esta localidad (Achinelly et al., 2011). Por tales motivos, uno de los principales proyectos del laboratorio incluyen la caracterización de este nuevo aislamiento y evaluación de su potencialidad como agente de biocontrol de insectos plaga de importancia para el cinturón hortícola platense. Las actividades a desarrollar incluyen una primera etapa de optimización de la producción y mantenimiento en el laboratorio in vivo e in vitro, la evaluación de la patogenicidad y especificidad parasitaria, como así también su implementación en poblaciones naturales de insectos. Ensayos en ambientes naturales y en laboratorio han sido realizados poniendo de manifiesto el gran potencial que presenta este entomonemátodo como agente de biocontrol en larvas de lepidópteros, coleópteros, y ortópteros (Achinelly et al., 2012; Eliceche et al., 2012). El tiempo de producción de nemátodos a partir de insectos parasitados se produjo de manera similar a otros nemátodos entomopatógenos, entre los días 11 a 22 post-infección para las larvas, con un promedio de 15 días y una duración aproximada de una semana hasta emerger la totalidad. Un número que varió entre 900 a 205000 juveniles infectivos fueron producidos por larva infectada, dependiendo del hospedador utilizado. Entre las principales plagas a evaluar se encuentra Lobiopa insularis (Laporte), (Coleoptera: Nitidulidae), herbívoro generalista que fue registrado recientemente como plaga emergente en el cultivo de frutilla. Sus hábitats y recursos alimenticios son variados y los adultos son atraídos por frutos maduros de frutilla donde se alimentan. Anualmente produce importantes daños económicos en predios fruti-hortícolas del Cinturón Hortícola Platense en la Pcia. de Buenos Aires, Argentina, obligando a los productores a la utilización de insecticidas sintéticos para su erradicación. Hasta el momento no se han registrado parasitoides para esta plaga en la Argentina y los depredadores generalistas no disminuyen sus densidades significativamente. Los resultados demostraron la susceptibilidad de Lobiopa insularis (Coleoptera: Nitidulidae) a esta cepa nativa de H. bacteriophora, constituyendo una alternativa valiosa y segura para el ambiente, especialmente para nuestra región. La mortalidad fue alta en larvas y pupas de L. insularis, (79 y 63%) respectivamente. Alrededor del 20% de las larvas y el 36% de las pupas infectadas, lograron pasar al siguiente estado y morir posteriormente. Heterorhabditis bacteriophora constituye el primer registro de un potencial agente de biocontrol sobre el coleoptero Lobiopa insularis. Actualmente estrategias de aplicación se están evaluando teniendo en cuenta la dinámica parásito hospedador . Las larvas de lepidópteros demostraron ser las más susceptibles a este aislamiento de H. bacteriophora, con valores superiores al 80% de parasitismo, en Galleria mellonella, Spodoptera frugiperda, e Hylesia nigricans. El lepidóptero Hylesia nigricans, es conocido vulgarmente como mariposa negra o bicho quemador. Su nombre responde a que las larvas, cubiertas por pelos urticantes liberan sustancias irritantes al contacto con la piel. En Argentina hay citadas numerosas especies de Lepidópteros causantes de estos problemas, siendo Hylesia nigricans la más frecuente nuestra zona. Esta especie es importante desde dos puntos de vista, como plaga de forestales, ornamentales y frutales a los cuales les ocasiona una defoliación importante y como causante de incomodidad a los seres humanos, por el efecto urticante que producen sus larvas y los adultos. En base a la mortalidad elevada ocasionada por H. bacteriophora, la actividad parasitaria de este nemátodo será evaluada en condiciones de campo, en poblaciones naturales sobre larvas y pupas de Hylesia nigricans. Entre las líneas de trabajo que agrupa este laboratorio se encuentra el estudio de nematomorfos, parásitos de insectos, grupo hermano de Nematoda, con quienes comparten muchas características morfológicas y de ciclo de vida (especialmente con los mermítidos). En este sentido se ha realizado una profunda revisión sistemática de la fauna argentina de Gordiida (Nematomorpha) desarrollando estudios sobre la morfología estructural y ultraestructural, utilizando microscopia óptica y microscopia electrónica de barrido de las distintas especies y su distribución (Zanca y de Villalobos 2007). También se ha realizado investigaciones sobre la misma temática de fauna sudamericana (de Villalobos y Zanca 2001, de Villalobos et al. 2009) y de otras regiones del mundo (Zanca et al. 2006). Se realizaron revisiones de algunos géneros y especies conflictivas de Gordiida, que permitió aclarar la real posición de los ejemplares estudiados y reducir el número de géneros de 21 a 19 (Zanca y Schmidt-Rhaesa 2006,) y la revisión de 4 géneros: Beatogordius, Noteochordodes; Paragordius y Chordodes. Se han abordado distintos aspectos del ciclo de vida de este taxón, desarrollando investigaciones sobre el desarrollo embrionario, las relaciones que se establecen entre estos parásitos y sus hospedadores, su comportamiento y la supervivencia de los adultos y larvas, y las estrategias reproductivas (Zanca 2003). Recientemente, se ha comenzado con la implementación de técnicas moleculares para realizar estudio filogenéticos.