Rol de la modificación de lípidos de membrana en la criopreservación de ovocitos bovinos.

BUSCHIAZZO, J.; RÍOS, G.; ANTOLLINI, S.S.; ALBERIO, R.

Buenos Aires

Congreso; 2do Congreso Internacional de la Sociedad Argentina de Tecnologías Embrionarias; 2014

Sociedad Argentina de Tecnologías Embrionarias

Objetivos Modular el nivel de colesterol y ácido linoleico de la membrana de ovocitos bovinos madurados in vitro, evaluar su estado biofísico (fluidez de membrana) a bajas temperaturas y la activación de caspasas post-vitrificación. Métodos experimentales Los ovocitos se maduraron durante 22 horas en un medio definido con modificaciones según su grupo de tratamiento. Los tratamientos fueron: control (EGF, libre de suero), en presencia de 43 μM de ácido linoléico, madurados en el medio control y cargados con colesterol (últimas 2 horas de maduración) y madurados combinando estos dos últimos tratamientos (ácido linoleico + colesterol). Los ovocitos se vitrificaron en soluciones de composición definida con el dispositivo Cryotop. Para la determinación del status apoptótico se evaluó la activación de caspasas por medio de un inhibidor específico (VAD-FMK) conjugado con FITC. El agregado y la remoción del colesterol se indujeron utilizando metil-β-ciclodextrina 15 mM acomplejada con colesterol o sola. El estado biofísico de las membranas de ovocitos y células del cumulus se evaluó a temperaturas decrecientes (38,5°C, 25°C, 15°C, 5°C, -5°C, -10°C) mediante espectroscopía de fluorescencia utilizando la sonda Laurdan. Para el análisis estadístico se usó SAS. Resultados No se encontraron diferencias en el porcentaje de activación de caspasas en ovocitos madurados con ácido linoleico y vitrificados con respecto al control vitrificado (10,6 vs 10,8%). Por otro lado, cuando se cargó colesterol en los ovocitos previo a la vitrificación y se removió luego del calentamiento, el porcentaje de activación de caspasas fue un 26% mayor que el control vitrificado. La combinación de las dos modificaciones lipídicas (ácido linoleico + colesterol) indujo un incremento del 77% en el nivel de caspasas activadas en comparación con el control vitrificado. Los estudios biofísicos revelaron que los ovocitos cargados con colesterol muestran un estado de la membrana más ordenado en el rango de los 20°C a los -5°C mientras que entre los -5°C y los -12°C este efecto se revierte mostrando un estado más fluido que los controles. El efecto del agregado de colesterol en las células del cumulus causó un aumento en el orden de la membrana en todas las temperaturas hasta los 5°C. A partir de los 0°C este efecto deja de observarse y el orden de las membranas de las células cargadas con colesterol se hace semejante a los de la condición control. Conclusión La incorporación de ácido linoleico en los ovocitos madurados in vitro no modificó el status apoptótico post-vitrificación. A temperatura fisiológica, el estado más fluido de la membrana de los ovocitos cargados con colesterol explicaría el aumento en la activación de caspasas. Este efecto se intensifica cuando además de colesterol se incorpora un ácido graso insaturado como el ácido linoleico. Por lo tanto, la vitrificación de estos ovocitos debería llevarse a cabo a temperaturas menores a la fisiológica. Más aun, el agregado de colesterol aumentó la fluidez de la membrana a muy bajas temperaturas. Estas modificaciones en los lípidos de membrana podrían prevenir parte del daño producido por la criopreservación haciéndola más tolerante a la criopreservación.