CULTIVOS PRIMARIOS DE HEPATOCITOS EN SÁNDWICH DE COLÁGENO? (CPHS): UN NUEVO MODELO ``IN VITRO`` PARA EL ESTUDIO DE ALTERACIONES DE TRANSPORTE CANALICULAR INDUCIDAS POR AGENTES COLESTÁSICOS

MISZCZUK, GS; BAROSSO, IR; ZUCCHETTI, AE; BOAGLIO, AC; PELLEGRINO, JM; SÁNCHEZ POZZI, EJ; ROMA, MG; CROCENZI, FA

Mar del Plata

Congreso; LVIII Reunión Anual de la SAIC; 2013

Sociedad Argentina de Investigación Clínica

Los modelos celulares polarizados para el estudio de las alteraciones de transportadores canaliculares en colestasis, como las duplas aisladas de hepatocitos, poseen bajo rendimiento celular y corta vida útil (6-7 hs). Los CPHS forman una red de pseudocanalículos que conservan durante varias semanas su capacidad funcional y metabólica. Se evaluó su utilidad para estudiar alteraciones funcionales del transportador canalicular Mrp2 inducidas por los agentes colestásicos modelo estradiol 17ß-D-glucurónido (E17G) y taurolitocolato (TLC). Hepatocitos aislados con colagenasa fueron sembrados en placas de 6 pocillos recubiertas con 100 µl de colágeno gelificado (3 mL/pocillo, 4,5 x105 cél/mL) con medio DMEM adicionado con suero fetal bovino, antibióticos, dexametasona, insulina y glucosa. A las 24 hs, se agregó una segunda capa de colágeno, renovándose el medio. Al día 3, se expusieron los CPHS a E17G (25-200 µM) o TLC (1-2,5 µM) por 30 min sobre una platina termostatizada en un microscopio de epifluorescencia. Finalmente, se agregó cloro-metilfluoresceína-diacetato (2,5 μM), precursor del sustrato fluorescente de Mrp2 glutatión-metilfluoresceína, tomándose fotografías digitales cada min, por 10 min. Se seleccionaron70-100 pseudocanalículos y se midió la intensidad promedio de fluorescencia, graficándose la misma vs. tiempo y ajustándose los datos por regresión lineal (pendiente = ?velocidad inicial de transporte? - VIT). E17G y TLC disminuyeron VIT en forma concentración-dependiente (Control=22,6±1,2; E17G: 25 µM=19,2±2,3; 50 µM=15,1±1,3; 100 µM= 14,1±0,2*; 200 µM=12,3±1,1*; TLC: 1 µM=19,2±1,8; 1,5 µM=13,0±1*; 2 µM=11,5±0,3*; 2,5 µM=6,7±1,3*; *p<0,05 vs. control, n=3-10). Concluimos que los CPHS son unmodelo factible de ser usado para estudiar las alteraciones funcionales secretoras en colestasis, en particular cuando se requieren altas cantidades de proteína (ej.: Western Blot), o suficiente vida útil para modular la expresión génica (ej.: ?knockdown? con ARNi).