CUANTIFICACIÓN DE ACTIVIDAD FERULOIL ESTERASA BACTERIANA MEDIANTE ESPECTROFOTOMETRÍA: PUESTA A PUNTO Y CARACTERIZACIÓN ENZIMÁTICA EN CEPAS DE LACTOBACILOS

ANDRADA, LE; LÓPEZ RIZO, MC; ABEIJÓN-MUKDSI MC; MEDINA, RB

Buenos Aires

Congreso; XV Congreso Argentino de Microbiología (CAM 2019); 2019

AAM

Las feruloil esterasas (FE) sonenzimas de creciente interés biotecnológico dada sus variadas aplicaciones. Lastécnicas para el estudio de las FE de bacterias lácticas (BL), de especialrelevancia en el desarrollo de probióticos e inoculantes para ensilajes,abarcan la espectrofotometría de nitrofenil derivados, la cual requiere quedichas enzimas se encuentren purificadas [Fritsch y col, 2017], y lacromatografía líquida de alta precisión [Abeijón y col, 2011]; estas metodologías son laboriosas y relativamentecostosas. Por tanto, el objetivo deeste trabajo es describir un protocolo novedoso de cuantificación de ActividadFE (AFE) aplicable para suspensiones celulares de BL; seguidamente, evaluar lafiabilidad de dicho método para caracterizar la AFE en diferentes condicionesde temperatura y pH. Materiales ymétodos: Suspensiones de células bacterianas en buffer MOPS 100 mM pH 7 fueronincubadas a 37°C en proporción 1:2 con una solución de metil ferulato 100 μM en dicho buffer. Tras 15 min, lamezcla de reacción fue sometida a centrifugación y la absorbancia de lafracción superior del sobrenadante se midió a 340 nm. Para la cuantificación seempleó una curva de calibración del sustrato (0-83 μM) expresando los resultados en Unidades (U) de ActividadEnzimática Específica, equivalentes a nm de metil ferulato consumidos/min/g decélulas. Además, se evaluó la técnica a 18°C, así como a pH 4 y 5 (37°C,acidificación con ácido láctico). Los valores obtenidos se compararon con la cuantificaciónde metil ferulato mediante HPLC y con la estimación por diámetro del halo dehidrólisis en medio MRS agar con la adición de etil ferulato (1 g/L). Losestudios estadísticos se realizaron mediante ANOVA y las medias fueron comparadasmediante el Test de Tukey. Resultados:El sustrato fue estable en todas las condiciones estudiadas y los valoresobtenidos son consistentes (Factor cepa=p<0,0001),variando de 35 U ({L. spp} aislada de silos de maíz) a 698 U ({L. johnsonii}CRL1231 a pH 7 y 37°C). Los resultados son coincidentes con los obtenidos porlos otros métodos de cuantificación mencionados. Las BL de origen animal yhumano estudiadas poseen una AFE de 1,5 a 20 veces mayor a la detectada en las cepasde origen vegetal. En la mayoría de los casos, las mayores U se encontraron apH 7 y 37°C; sólo 4 cepas, aisladas de fuentes vegetales, presentaron una mayorAFE a pH 4 y 5, o a 18°C. Conclusiones: Se presenta un método consistente,rápido y de bajo costo para la cuantificación de la AFE, basado en lametodología publicada por Yue y col. (2009) para enzimas purificadas, y queasimismo permite la caracterización de las condiciones óptimas en cada caso. Losresultados sustentan la potencial aplicación de BL de origen intestinal caprinocomo inoculantes fibrolíticos para ensilajes; se destacan especialmente lasespecies {L. johnsonii}, {L. taiwanensis} y {L. fermentum} por su grancapacidad hidrolítica, la cual se mantiene a temperatura y pH bajos.