Seroprevalencia regional de brucelosis porcina. Hallazgos preliminares.

CASTRO HA,; GONZALEZ SR,; PRAT MI,; PABLO CESAR BALDI

Bahía Blanca

Congreso; III Jornadas Interdisciplinarias del Sudoeste Bonaerense.; 2004

Introducción                         La brucelosis es una enfermedad zoonótica causada por varias especies de bacterias pertenecientes al género Brucella que constituye un problema sanitario para los individuos que mantienen un estrecho contacto con el ganado (López Merino, 1989).          En nuestro país, una de las principales especies responsables de brucelosis en el hombre es Brucella suis (Aréstegui y col, 2001). En el cerdo, portador natural de esta bacteria, la infección se caracteriza por provocar abortos y esterilidad en las hembras, orquitis en los machos y una elevada mortalidad en los lechones. La enfermedad es de amplia difusión ya que un gran número de animales aparecen infectados al mismo tiempo, con la consiguiente pérdida económica y el potencial riesgo ocupacional que esto representa. La verdadera situación regional de esta infección es desconocida, si bien estudios realizados entre los años 1960 y 1980 revelaron una prevalencia del 14,5 ? 25,0 %. Actualmente no hay programas formales de control de brucelosis porcina, no obstante, en los criaderos importantes se realizan pruebas serológicas para evaluar el estado sanitario de los animales. El hallazgo de serología positiva es más frecuente en pequeños criaderos, que mantienen cerdos para su propio consumo o comercio local (Sanmartino, 2002), probablemente debido a la precariedad de sus instalaciones. Si bien el diagnóstico de certeza en brucelosis es el bacteriológico, los inconvenientes de su implementación hacen que los métodos de diagnóstico más difundidos sean los serológicos. Dentro de éstos, los más ampliamente utilizados son las aglutinaciones con suspensiones de bacterias enteras y la fijación de complemento. En ambos casos se detectan anticuerpos contra los componentes de la membrana externa, de los cuales el lipopolisacárido (LPS) es el más importante. Dada la reactividad cruzada existente entre el LPS de Brucella y el de otras bacterias Gram negativas, es frecuente la aparición de falsos positivos. La Organización Mundial de la Sanidad Animal recomienda la realización de pruebas inmunoenzimáticas (ELISA) para el diagnóstico de brucelosis en distintas especies animales (OIE, 1996). Esta metodología, además de ser altamente sensible, requiere pequeñas cantidades de suero y permite trabajar aún con sueros hemolizados. El empleo de antígenos distintos de LPS en estas pruebas otorga mayores niveles de especificidad, disminuyendo la incidencia  de reacciones cruzadas (Seco-Mediavilla  y col, 2003).  El objetivo de nuestro estudio fue la determinación de la seroprevalencia de brucelosis porcina en el sudoeste de la provincia de Buenos Aires empleando como prueba tamiz la aglutinación en placa con antígeno tamponado (BPA), y como pruebas suplementarias dos técnicas de ELISA, con dos antígenos diferentes, uno de ellos libre de LPS.  La realización de este estudio aportará datos que podrán ser de relevancia en el control de esta zoonosis y sugerirá la extensión del mismo a otras zonas con características similares.  Materiales y Métodos Muestras analizadas                         Las muestras de sangre se obtuvieron en el momento del faenado del los animales, bajo la supervisión de un médico veterinario. Luego de la separación de los sueros, éstos se mantuvieron a ?20 °C hasta el momento de su procesamiento. Aglutinación en placa con antígeno  tamponado (BPA)                         Se siguió la técnica descripta por Angus  y Barton (Angus and Barton, 1984). Se mezclaron, en placas de vidrio, 80 ml del suero a analizar con 30 ml de antígeno de Brucella (suspensión al 11 % de B. abortus 119-3 con cristal violeta y verde brillante, pH 3,65). Luego de incubar las placas 4 minutos a temperatura ambiente, se rotaron, se volvieron a incubar 4 minutos previo a la observación. Antígenos empleados en las pruebas de ELISA                          La fracción citoplasmática (CYT) se obtuvo a partir de cultivos de B. abortus S19, tratados con formaldehído, lisados en ?X-Press? y ultracentrifugados, según la técnica de Verstreate y col (Verstreate y col., 1982). La fracción de proteínas citoplasmáticas libre de LPS (CP) se preparó adsorbiendo el antígeno CYT con un anticuerpo monoclonal (BC68) específico para el epitope repetitivo del antígeno ?O? (Goldbaum y col., 1994). Este anticuerpo retiene al LPS dejando libres las proteínas citoplásmáticas.  Determinación de anticuerpos anti?LPS y proteínas asociadas a LPS (ELISA-CYT)                         Las microtiras de poliestireno se sensibilizaron con  antígeno CYT  diluido en buffer fosfato  (PBS) (2 mg/pocillo). Se bloquearon con una solución de leche descremada al 3 % en PBS. Luego de tres lavados con PBS-Tween 20 0,05 % (PBS-Tween), se incubaron con una dilución 1:200 de los  sueros a analizar durante una hora a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS-Tween se agregó el conjugado anti-porcino marcado con peroxidasa. El revelado se efectuó con o-fenilendiamina (2 mg/ml). La reacción se frenó por el agregado de H2SO4 4 N. La lectura de color se efectuó a 490 nm en un lector de microtiras de ELISA. Determinación de anticuerpos anti-proteínas citoplasmáticas (ELISA-CP)                         Las microtiras se sensibilizaron con fracción CP (0,5 mg/pocillo). Luego del bloqueo se incubaron con las diluciones de los sueros a analizar durante una hora a temperatura ambiente. La incubación con el conjugado y el revelado se realizó según lo indicado en el punto anterior.  Resultados  Se analizaron 110 muestras provenientes de criaderos de las zonas de Bajo Hondo (n=22,) Médanos (n=26), Carhué (n=26), Tres Lomas (n=12), Bahía Blanca (n=8) y Guaminí (n=16).  Se analizó un criadero de cada zona. En la Figura 1 se muestra un mapa de la provincia de Buenos Aires en el que se indica el porcentaje de positividad obtenido para la prueba de BPA  en cada zona estudiada.                          Del total de muestras analizadas un 24,5 % (27sueros) fue positivo para la prueba de BPA, de estos sueros, un 92,5 % (25 sueros) fue positivo también para ELISA-CYT y un 77,7 % (21 sueros) para ELISA-CP Un suero negativo para BPA fue positivo para ELISA-CYT y ELISA-CP. Cinco sueros negativos para BPA fueron positivos para ELISA-CYT y negativos para ELISA-CP, y dos sueros negativos para BPA y ELISA-CYT fueron positivos para ELISA-CP (Figura 2). El punto de corte (cut off) para cada ensayo se determinó como el promedio de las densidades ópticas obtenidas para 70 sueros BPA negativos más 3 desvíos estándares y fue 0.388 para ELISA-CYT y 0.436 para ELISA-CP.  Conclusiones                         Los porcentajes de positividad obtenidos en la prueba de BPA coinciden con lo registrado en la bibliografía.                         La mayor sensibilidad del ELISA-CYT permitió detectar otros seis sueros positivos, que habían resultado negativos para BPA. El menor porcentaje de sueros BPA positivos que son también positivos para ELISA-CP se puede atribuir a la menor inmunogenicidad de las proteínas citoplasmáticas en comparación con el LPS. La positividad para ELISA-CP observada en dos sueros negativos para BPA y ELISA-CYT puede deberse a la existencia de una reacción cruzada posiblemente con proteínas de Yersinia enterocolítica (Kitelberger y col, 1995).                         Los animales estudiados al momento de la faena no presentaban características clínicas relevantes asociadas a la infección, lo que en principio sugiere considerar a los animales con serología positiva como portadores de una brucelosis subclínica. Resulta interesante observar la ubicación preferencial de los animales con serología positiva, tal como lo muestra el mapa de la Figura 1, lo que propone investigar las causas que la motivan.  Si bien es bajo el número de muestras estudiadas, estos resultados preliminares alertan sobre el riesgo de infección para el hombre en contacto con estos animales y sugiere la aplicación futura de medidas preventivas.