Unterschiede in der Differenzierung von murinen embryonalen Stammzellen in insulinproduzierende Zellen.

NAOJUK O; FRANCINI F; JÖRNS A; TIEDGE M; LENZEN S

Berlin, Alemania

Simposio; 40 Jahresagung Deutsches Diabetes Gesellschaft.; 2005

Deutsches Diabetes Gesellschaft

Fragestellung: Der Einsatz von embryonalen Stammzellen in der Zellersatztherapie des Typ I Diabetes Mellitus stellt eine vielversprechende Alternative der Insulinsubstitution dar. Um das Differenzierungsprotokoll zu optimieren, wurde der Einfluss von verschiedenen Zellkulturbedingungen auf die Differenzierung von embryonalen Stammzellen in insulinproduzierende Zellen untersucht.Material und Methoden: Murine embryonale Stammzellen der Linie ES-D3 wurden mit verschiedenen Zellkulturprotokollen zu insulinproduzierenden Zellen differenziert. Die Expression betazell-spezifischer Gene sowie embryonaler Marker wurde mittels quantitativer Real-Time RT-PCR analysiert. Zusätzlich wurden morphologische Änderungen mit Elektronen? (EM) und Lichtmikroskopie dokumentiert.Ergebnisse: Im Laufe der Differenzierung erwerben die Zellen ein Genexpressionsprofil, das deutliche Charakteristika insulinproduzierender Zellen zeigt. Dies gilt besonders für die Expression endokriner Hormone (Insulin, Glucagon, Somatostatin). Die Expression embryonaler Marker, (ERas, Oct4) wurde im Zuge der Differenzierung deutlich reduziert. Im letzten Differenzierungsstadium konnten jedoch Zellen embryonalen Charakters mittels EM und PCR nachgewiesen werden. Dies traf insbesondere zu, wenn die Differenzierung in Spinner-Zellkulturflaschen durchgeführt wurde. EM-Untersuchungen zeigten auch, daß die Zellviabilität durch Apoptose und Nekrose beeinträchtigt war. Serumzusatz im Differenzierungsmedium führte zu einer Zunahme der Expression betazellspezifischer Marker und zu einer stärkeren Ausprägung morphologischer Differenzierungsmerkmale. Insbesondere bei einer Serumkonzentration von 5 % konnten Granula als Merkmale insulinproduzierender Zellen nachgewiesen werden.Schlussfolgerung: Embryonale Stammzellen können in-vitro zu insulinproduzierenden Zellen differenziert werden. Serumfreie Differenzierungsmedien erhöhen die Apoptoserate dieser Zellen. Eine Optimierung der Zellkulturmedien in Bezug auf Serum- und Nährstoffsupplementierung führt daher zu einer signifikanten Verbesserung des Differenzierungserfolgs.