Metilación y expresión de TP73 en carcinomas de mama.

NADIN S.B.; GOMEZ L.C.; SOTTILE M.L.; MARZESE D.M.; FLAMINI M.I.; GAGO F.E.; OROZCO J.; TELLO O.M.; ROQUÉ MORENO M.; VARGAS ROIG L.M.

Mendoza

Jornada; XIII Jornadas de Investigación de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad de Cuyo.; 2014

Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad de Cuyo.

Introducción: En el año 2013, el Programa Nacional para el Control del Cáncer de Mama creado por el Ministerio de Salud de la Nación propuso reducir la morbimortalidad por esta patología, que se mantiene estable en Argentina desde 1980, produciendo alrededor de 5.400 muertes anuales [Viniegra M 2011]. Una de las estrategias para lograr este objetivo consiste en garantizar el tratamiento adecuado y oportuno de las pacientes, es decir que no resulte insuficiente ni excesivo. Para ello es necesario que el diagnóstico de la agresividad biológica del tumor sea lo más preciso posible. En algunas circunstancias, como es el caso de los estadíos avanzados, donde las pacientes presentan infiltración tumoral de los ganglios linfáticos, la decisión de realizar quimioterapia está consensuada. Sin embargo, en aquellas pacientes en estadíos tempranos de la enfermedad, donde no existe invasión tumoral de los ganglios linfáticos y cuyos tumores expresan receptores hormonales, la decisión sobre la adición de quimioterapia a la hormonoterapia es controvertida. En este último grupo de pacientes la correlación de los resultados de estudios genómicos con las variables clínico-patológicas clásicas representa un gran avance en la decisión terapéutica. Análisis retrospectivos han demostrado la capacidad de las firmas genómicas para clasificar a las pacientes en categorías de riesgo sumando valor pronóstico a las variables clínico-patológicas clásicas: tamaño tumoral, grado tumoral o histológico (que comprende el grado de diferenciación, el índice mitótico y el pleomorfismo nuclear) y compromiso de ganglios linfáticos regionales. En tumores de mama triple negativos (que no expresan receptores de estrógeno ni progesterona ni HER2) se ha observado un perfil de metilación tumoral específico definido por la metilación de 5 genes (entre los que se encuentra p73) y la no metilación de 11 genes [Branham et al., Oncogenesis 1: e17, 2012]. También se ha observado que la metilación aberrante del gen p73 (en la región +258 pb) en carcinomas ductales infiltrantes correlacionó con alto grado histológico que es uno de los principales marcadores de mal pronóstico [Marzese DM. et al., J Molecular Diagnostics 14: 613, 2012]. El gen p73 pertenece a la pequeña familia del gen p53 [Collavin et al., Cell Death Differ 17: 901, 2010]. Desde su descubrimiento en 1997, se ha estudiado el gen p73 debido a que puede compensar la pérdida de función de p53. Después de un daño al ADN, p73 puede desencadenar la detención del ciclo celular, senescencia y apoptosis promoviendo la transcripción de varios genes blanco de p53. Sin embargo, a diferencia de p53 que se encuentra mutado en más del 50% de los tumores humanos, p73 raramente está mutado (menos del 1%), convirtiéndolo en un interesante blanco de terapias antitumorales [Bisso et al., Current Pharmaceutical Design. 17: 578, 2011]. Para avanzar en la búsqueda de nuevos marcadores de agresividad tumoral en cáncer de mama, nuestro objetivo general es determinar la utilidad de la metilación y/o el silenciamiento de ciertos genes supresores tumorales. Objetivo: Determinar si la metilación del gen p73 en carcinomas mamarios se relaciona con su expresión proteica. Métodos: Pacientes: Hasta la fecha se incorporaron en el estudio los tumores de 23 pacientes con cáncer de mama. Estas pacientes corresponden a un grupo de 69 pacientes inicialmente estudiadas en el protocolo ?Estudio del silenciamiento epigenético de genes supresores tumorales en cáncer de mama? que junto con el correspondiente consentimiento informado fueron aprobados por el Comité de Bioética de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad Nacional de Cuyo. Ninguna paciente recibió tratamiento previo a la cirugía.  Metilación: La metilación del gen p73 en estas muestras ha sido reportada previamente [Marzese et al., 2012].  Inmunohistoquímica: Se realizaron cortes de 5 µm de los tejidos incluidos en parafina.  La recuperación antigénica se realizó  con 0,01 M buffer citrato, pH 6. Las muestras se incubaron con el anticuerpo primario  anti-p73 (Abcam) durante toda la noche a 4°C y luego con el segundo anticuerpo anti-conejo y el complejo avidina-biotina peroxidasa (Elite Vectastain ABC kit, Vector). La inmunotinción se realizó con 0,5 mg/mL de diaminobencidina / 0,01% de peróxido de hidrógeno y la contratinción con Hetamoxilina de Harris. Los preparados fueron evaluados utilizando un microscopio Nikon Eclipse E200 (Japan). La inmunotinción se evaluó según intensidad y proporción utilizando el siguiente puntaje: a) intensidad: sin tinción 0, tinción débil 1, tinción moderada 2 y tinción fuerte 3; y b) proporción: <1 % = 0, 1-10% = 11-30% = 2, 31-66% =3 y >66% = 4 [Vargas Roig LM.et al.  Molecular Oncology 2:102, 2008]. Análisis estadístico: Se utilizó test de Fisher para evaluar la relación entre la metilación y la expresión del gen (programa GraphPad Prism 5). Resultados: Se realizó la evaluación de la expresión proteica de p73 en los tumores de las 23 pacientes. En un caso (CM65) se evaluaron dos muestras debido a que la paciente presentaba carcinoma bilateral. En la Tabla 2 se presentan los resultados de la metilación de p73 (+258) y p73 (+25) junto con la expresión de la proteína. En 12 casos se observó metilación de p73 (+258) y solamente en 2 casos metilación de p73 (+25). En 3 muestras no se pudo evaluar la expresión de p73 porque no se observaban células tumorales en el taco de parafina seleccionado. En los 3 casos donde no se expresó la proteína P73 en las células tumorales, el gen p73 (+258) estaba metilado. Sin embargo, en el 67% de los casos, la metilación de una o de las dos regiones estudiadas no se relacionó con la ausencia o disminución de la expresión proteica (Tabla 3). En la Figura 1 se presenta un ejemplo de la inmunotinción de P73 en una muestra de carcinoma ductal invasor (paciente CM26), donde se observa expresión nuclear de elevada intensidad y proporción. Este tumor presentaba metilación p73 (+258) y p73 (+25). Conclusiones: Esta falta de correlación entre los resultados obtenidos (metilación y expresión del gen) puede deberse, en parte a la heterogeneidad del tumor, recordando que los estudios genómicos y proteómicos se realizaron en dos muestras distintas tomadas de la misma región tumoral.