El ácido retinoico reduce la migración de células de cáncer de mama: rol del receptor de ácido retinoico beta

FLAMINI M.I.; GAUNA G.; VARGAS ROIG L.M.

Mendoza

Jornada; XII Jornadas de Investigación de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad Nacional de Cuyo; 2012

Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad Nacional de Cuyo.

En trabajos previos llevados a cabo por este laboratorio se observó que la metilación del gen que codifica al receptor del ácido retinoico beta (RAR-beta) en tumores primarios de mama se correlaciona con la invasión del ganglio centinela. Conociendo que los intentos para identificar las bases moleculares implicadas en la metástasis son fundamentales para la predicción temprana de la evolución de la enfermedad y el desarrollo de nuevas terapias moleculares, es que el presente proyecto propone verificar si la metilación aberrante del gen RAR-beta se correlaciona con mayor agresividad del tumor, es decir aumento en la migración e invasión, procesos fundamentales en el desarrollo de metástasis. OBJETIVOS: Nuestra hipótesis es que el RAR-beta está involucrado en la migración e invasión celular. Así la metilación y silenciamiento del gen RAR-beta en células tumorales mamarias se correlaciona con mayor migración e invasión celular. Los objetivos específicos del presente trabajo son: 1) Verificar en células MCF7 (RAR-beta metilado y silenciado) si la re-expresión del gen, después del tratamiento con ácido retinoico (AR), inhibe la migración celular. 2) Determinar en células T47D (RAR-beta expresado) si silenciando este gen aumenta la migración celular. 3) Identificar los posibles mecanismos moleculares por los cuales AR/RAR-beta ejerce su efecto. MATERIALES Y MÉTODO: Para poner a prueba la hipótesis planteada se utilizó la línea de adenocarcinoma de mama T47D que por bibliografía se sabe que no tiene metilado el promotor de RAR-beta y se compararon los resultados con los obtenidos en la línea celular MCF7 carcinoma de mama invasivo que sabemos que si tiene metilada dicha región génica. En células MCF-7 se realizaron tratamientos de dosis (10-8 a  10-5 M) y tiempo dependencia (24 a 96hs) con ácido retinoico (AR). Se realizaron ensayos de viabilidad (MTT), migración celular y mediante western blot se evidenció la expresión de RAR-beta, moesin, c-Src, HSP27 (HSPB1) y actina en ambas líneas celulares. RESULTADOS: Los ensayos de viabilidad celular (MTT) en células MCF7 y T47D demostraron que 72hs de incubación con AR no reduce la viabilidad celular salvo en la línea MCF7 cuando se  administran elevadas  concentraciones (10 µM) donde la viabilidad disminuye un 20%. Además observamos que en la línea MCF7 se produce una inhibición de la migración celular en un 60% (p < 0.01) a partir de la concentración de AR de 1µM, la cual no afectaba la viabilidad. Observamos también que la administración de AR en células MCF7 induce la expresión del gen RAR-beta que es máxima luego de 72hs y a una concentración 1µM. Paralelamente luego del tratamiento con AR (1µM/ tiempodependiente) disminuye muy significativamente la expresión de proteínas que estimulan la migración como moesina, c-Src y HSP27. Por otro lado un grupo de células MCF7 fue tratado con AR (1µM/72hs) y otro grupo de células fue transfectadas con un siRNA control o siRNA RAR-beta. Se realizó un ensayo de migración celular, y observamos  que el AR disminuye la migración. Cuando las células fueron transfectadas con el siRNA RAR-beta, el AR no logró inhibir la migración, lo que sugiere que el AR inhibe la migración por medio del RARβ. Además en las células MCF-7 donde fue silenciado el RAR-beta, el AR no logra reducir la expresión de las proteínas moesina y HSP27, lo cual  indicaría que el AR reduce la expresión  de  estas  proteínas  relacionadas con  la migración por medio del RAR-beta. Mientras que en células T47D si hay una significativa disminución de la expresión de estas proteínas en los tratamientos con siRNA. También observamos que el AR por medio del RAR-beta estaría inhibiendo la migración puesto que en células T47D que si expresan el receptor, si lo silenciamos por medio de siRNA el AR no ejerce su efecto. CONCLUSIÓN: De acuerdo a los resultados obtenidos  podemos concluir que el AR por medio del RAR-beta inhibe significativamente la migración de células MCF7 y T47D modulando diferencialmente la expresión de proteínas involucradas en la migración/invasión  celular. Estos resultados aumentan nuestra comprensión de la biología celular del cáncer de mama y podrían tener relevancia clínica para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para interferir en la aparición de metástasis.