ESTUDIO DE UN PROCESO PARA OBTENER AVIDINA A PARTIR DE CLARA DE HUEVO EN BASE A FIBRAS SULFONICAS

AGUILERA, MIRNA; KIKOT, PAMELA; GRASSELLI, M.

CABA

Jornada; XIX JORNADAS DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA INDUSTRIAL ? JORFYBI 2019; 2019

SAFYBI

Introducción. La avidina es una glicoproteína de aproximadamente 68 kDa, compuesta por cuatro subunidades idénticas. Es una proteína básica, muy soluble en soluciones acuosas con una gran estabilidad a rangos amplios de pH y temperatura [1, 2]. La gran afinidad por la biotina la ha convertido en una herramienta muy importante para numerosos ensayos bioquímicos y separaciones de compuestos basadas en la afinidad [3]. Siendo su costo comercial en el orden de los 10U$S /mg.La avidina es un componente minoritario (0,05% de las proteínas totales) de los huevos de aves y ovíparos. Se han propuesto numerosas técnicas de purificación de avidina de la clara de huevo mediante cromatografía de intercambio iónico (CII) y de afinidad. Sin embargo, la avidina purificada por CII se copurifica con lisozima dado que ambas tienen puntos isoeléctricos muy cercanos. Las cromatografías de afinidad mediante ligandos específicos simil-biotina permiten obtener valores altos de purificación y recuperación del producto pero el costo dificulta su aplicación a gran escala [1, 3]. El objetivo de este trabajo es desarrollar un proceso de purificación de avidina a bajo costo. Para ello se lleva a cabo una CII utilizando fibras de algodón sulfónicas, que fueron previamente desarrolladas en nuestro laboratorio. Posteriormente, se estudia a la cromatografía de iones metálicos inmovilizados (IMAC) como un sistema para eliminar las proteinas contaminantes.Materiales y métodos. La preparación de la solución de clara de huevo libre de mucinas fue preparada por dilución 1:6 de la clara de huevo líquida pasteurizada comercial (EGG Cellence) en buffer acetato 20 mM pH 4,8 [6]. Las fibras de algodón sulfónicas se preparan según un trabajo previo [7]. Se empaca una columna (10,7 cm x 2,7 cm de diámetro) utilizando una malla de PVC para evitar la compactación del lecho. La cromatografía se efectuó utilizando buffer fosfato 20 mM pH 7,0 con la adición de NaCl 1 M para la elución, a un caudal de 5 ml/min. La columna fue conectada a un detector UV en línea y a un colector de fracciones automático. Una matriz IMAC Sepharose 6 FF comercial (volumen de columna: 1 ml) fue cargada con Cu(II), equilibrada y lavada con buffer fosfato 20 mM pH 7,0 NaCl 0,5 M. La concentración de proteínas se determinó por el método de Bradford y la de avidina mediante la técnica de HABA [8] modificada para lectura en microplaca, usando avidina comercial como estándar. El SDS-PAGE se efectuó con un gel al 15 % de poliacrilamida y tinción con Coomasie Blue R250. Resultados. Las fibras de celulosa son un producto agroindustrial utilizado básicamente para producir tejidos. Nuestro laboratorio desarrolló una fibra compuesta de celulosa y metacrilatos con grupos sulfónicos para ser aplicada en cromatografía [7]. En este trabajo se presenta la aplicación de estas fibras de celulosa sulfónicas para realizar un proceso de purificación de avidina de clara de huevo.Una columna empacada con las fibras sulfónicas fue cargada con 500 mL de solución de clara de huevo libre de mucinas conteniendo 5.6 g/L de proteínas totales (Fig 1). En la postsiembra fueron colectados 420 mL de líquido conteniendo 1.9 g/L de proteínas, mientras que en la elución se colectaron 190 mL conteniendo 0.1 g/L, siendo la recuperación de proteínas totales del 95 % y el 4,6 % se obtuvo en la fracción de elución. Como puede observarse en el SDS-PAGE de la Fig. 1, el eluído (E) se observa la presencia de 5 proteínas. Con respecto al crudo (C), E se enriquece en lisozima (14,4 kDa, pI 10.7) y en dos proteínas de 56 kDa y 48 kDa respectivamente. La ovotransferrina (76 kDa, pI 6.1) mantiene su proporción y la avidina (que es indetectable en C y en la postsiembra (PS) dada su proporción minoritaria) se observa levemente (ver flecha 16 kDa). En esta cromatografía se eliminan principalmente las proteínas mayoritarias ovoalbúmina (45 kDa, pI 4.5) y ovomucoide (35 kDa, pI 4.1) que constituyen el 65 % del contenido total de proteínas en la clara de huevo. En ensayos futuros se ejecutará la cromatografía a pH levemente mayor intentar reducir la adsorción de ovotransferrina. Fig. 1. CII. Cromatograma indicando siembra de la muestra, lavado y elución con NaCl 1 M. SDS-PAGE 15% de marcadores de P.M. (M) (60 kDa, 45 kDa y 14.4 kDa), la solución de clara de huevo libre de mucinas o crudo (C), la postsiembra (PS) y el eluído (E). SDS-PAGE de las eluciones con acido acético (AA) e imidazol 10 mM. STD: estándar de avidina. La flecha señala la presencia de avidina.La detección de avidina mediante el complejo con HABA mostró valores menor al límite de detección (0,02 mg/mL) en el crudo y la postsiembra, mientras que en el eluido la concentración fue de 0,05 mg/mL.Conociendo que la avidina presenta un residuo de histidina en superficie por subunidad se aplicó una IMAC-Cu(II) sobre una fracción de 20 ml del eluído de CII. Algunos trabajos anteriores mencionan el uso de IMAC para la separación de avidina pero sin resultados concluyentes [5, 9], mientras que está ampliamente estudiada para la lisozima [10, 11] en base a lo cual se eligieron los parámetros cromatográficos. Del total de proteínas sembradas en la IMAC, > 80% fueron adsorbidas por la matriz, incluyendo la avidina. Se estudió la elución diferencial con un gradiente de ácido acético 0,1 M según describe Durance [9], pero las proteínas eluídas fueron escasas y ausentes de avidina (ver Fig. 1C AA). Otra alternativa fue un buffer de elución con 10 mM imidazol logrando desorber el total de las proteínas en un pico único(ver Fig. 1C I).. Posteriormente, se efectuó una elución en escalones con concentraciones de imidazol entre 0,25 y 5 mM donde se observo que por cada cambio de buffer de elución se obtuvo un pico minoritario pero no se observó una elución diferencial de las proteínas.ConclusiónEn este trabajo se logró ejecutar la recuperación de proteínas básicas con fibras sulfónica producida a partir de materiales de muy bajo costo. En la misma se enriqueció avidina a partir de clara de huevo, logrando eliminar el 65 % de las proteínas contaminantes. Posteriormente, se ensayaron IMAC-Cu(II) en distintas condiciones de elución. Si bien la elución con medio acido logró una selectividad parcial, se requieren mayores estudios para optimizar el proceso de purificación de avidina utilizando IMAC. Referencias[1] Green, Michael (1975). Advances in Protein Chemistry 29. 85?133.[2] Bruch, White (1982). Biochemistry 21 (21). 5334?41.[3] Gésan-Guiziou (2013). Separation technologies in dairy and egg processing, Woodhead Pub, 341-380.[4] Chay Pak Ting, Pouliot, Gauthier, Mine (2013). Fractionation of egg proteins and peptides for nutraceutical applications, Woodhead Pub, 595-618.[5] Sulkowski (1985). Trends in Biotechnology 3 (1). 1-7.[6] Ventura, Fernández Lahore, Smolko, Grasselli (2008). Journal of Membrane Science 321 [7] Singh, Dsouza, Sánchez, Verma, Achilli, Vennapusa, Grasselli, and Fernández-Lahore (2015):. Separation and Purification Technology (143) 177-183.[8] Green (1970). Methods in Enzymology 18 A. 418-424.[9] Durance, Nakai (1988). Can. Inst. Food Sci Technology J. 21 (3). 279-286.[10] Proskova, Kucera (2002). Czech J. Food Sci 20 (3). 95-97.[11] Zhao, Sulkowski, Porath (1991). European Journal of Biochemistry 202 (3). 1115-1119.