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IntroducciónLa proteína A es un proteína de aproximadamente 48 kDa con capacidad de unir inmunoglobulina G (IgG) con gran afinidad. Esta proteína ha sido ampliamente estudiada y modificada para su aplicación en procesos biotecnológicos (purificación industrial de monoclonales) y en sistemas de diagnóstico que involucren IgGs. La proteína nativa contiene cuatro sitios de unión por la IgG, sin embargo por motivos estéricos solo 1 o 2 de ellos pueden ser ocupados simultáneamente. Dado que la expresión de proteínas recombinantes en E.coli es más eficiente con proteínas de bajo PM, se desarrolló previamente una proteína conteniendo solo dos subunidades, denominada AviPure [1] que además tiene agregada una etiqueta con la estructura His-Cys-His-Cys-His [2], la cual tiene una doble función: (i) permite su purificación por afinidad por iones metálicos inmovilizados (IMAC); y (ii) los grupos tioles de las Cys pueden ser utilizados para la inmovilización de la misma a matrices activadas con grupos epóxido, generando uniones tioeter químicamente muy estables.El objetivo de este trabajo fue la optimización de un proceso de fermentación de E.coli, la expresión y purificación del AviPure en la escala de 5 Litros.Materiales y métodosCepa y medio de cultivo. El cultivo se llevó a cabo empleando la cepa Escherichia coli BL 21(DE3 conteniendo el plásmido de expresión pET28a (+) conteniendo la secuencia codificante de AviPure [1]. El inóculo se preparó en medio LB con 4 g/L de glucosa. El cultivo en el fermentador BIOSTAT A+ de 5 L (Sartorius) se llevó a cabo usando el medio químicamente definido Riesenberg [3] con 20 g/L de glucosa y antibiótico. La solución de alimentación administrada durante el cultivo tuvo glucosa 300 g/L y MgSO4?7H2O 15 g/L. Etapas del cultivo. Se preparó un inóculo de 300 mL en Erlenmeyer a 200 rpm de agitación ON a 32°C. El bioreactor fue llenado con 3 L de medio de cultivo definido e inoculado. La DO600 inicial fue de 0,25 UA. El oxígeno disuelto (OD) se mantuvo > 10 % durante todo el cultivo mediante el aumento de la velocidad de agitación o bien mediante el cambio de insuflación de aire por oxígeno puro. La producción de espuma fue controlada automáticamente mediante la adición de antiespumante y el pH se mantuvo en 6,3 por la adición de una solución de amonio al 25 %. El cultivo batch se llevó a cabo a 37°C. La etapa batch alimentado se inició cuando los valores de DO600 se encontraron > 8 UA, bajando la temperatura 28°C y alimentando con solución de alimentación a un caudal constante. Posteriormente, se efectúa la inducción de la expresión de la proteína recombinante mediante el agregado de IPTG 1 mM concentración final. Durante esta etapa, el caudal de alimentación con solución de alimentación se redujo y la temperatura fue 22°C. La concentración de glucosa durante el cultivo fue monitoreada mediante un kit enzimático.Purificación de la proteína. Una porción de la biomasa obtenida fue resuspendida en buffer fosfato 20 M pH 7, 0,15 M NaCl, 4 mM EDTA y lisada mediante ultrasonido. Luego, fue centrifugada y el sobrenadante se empleó para purificar la proteína recombinante mediante IMAC-Ni(II). Para ello se empleó la matriz IMAC Sepharose 6 FF y un cromatógrafo de baja presión, con buffer de equilibrado fosfato 30 mM pH 7,5 300 mM NaCl 10 mM imidazol. La elución se efectuó con aumento de la concentración de imidazol (250 mM final). Las proteínas obtenidas se analizaron mediante SDS-PAGE 15 % de poliacrilamida y tinción con Coomasie Blue R250, y cuantificadas mediante la técnica de Bradford.ResultadosEl cultivo de la bacteria E.coli recombinante fue realizado en un medio mineral Riesenberg diseñado en base a la composición elemental de esta bacteria para obtener una biomasa de 60 g biomasa seca/L [3]. Dado su constitución en base a sales inorgánicas con el agregado de una fuente de carbono como glucosa o glicerol, resulta en un medio muy económico. La fermentación se llevó a cabo en tres etapas (Fig. 1A). Durante la etapa batch (0 a 5 h) a 37°C la velocidad específica de crecimiento (µ) se mantuvo en su valor máximo (µmax = 0,76 h-1) y el rendimiento fue 0,4 g de biomasa seca por g de glucosa; verificando el comportamiento óptimo de las variables del crecimiento. La etapa batch alimentado (5 a 24 h) se llevó a cabo bajando la temperatura a 28°C, promoviendo una µmax menor de forma de mantener el cultivo con insuflación de aire. La alimentación se efectuó a caudal constante de forma que la µ fuera mayor que la velocidad de dilución (µ inicial = 0,22 h-1), y consecuentemente la glucosa en solución dentro del reactor se mantuviera en valores cercanos a cero. Al cabo de estas etapas de desarrollo de un cultivo con alta densidad bacteriana, la DO600 llegó a 65 UA (85 g de biomasa seca). Luego de la inducción, durante la etapa de producción de proteína recombinante (24 a 29 h) la temperatura de cultivo se bajó a 22°C y el caudal de alimentación fue ajustado de modo que la µ inicial fuera menor de 0,24 h-1. Al final del proceso completo se obtuvieron 4,8 L conteniendo 24 g/L de biomasa seca. La DO600 alcanzada fue 170 UA.Una fracción de la biomasa (aprox 1%) fue lisada y purificada mediante IMAC. Se obtuvo un rendimiento de 14 mg/g de biomasa seca, con lo que se estima un rendimiento total de 1,6 g de proteína recombinante. Este rendimiento específico de proteína recombinante es aproximadamente 10 veces superior al alcanzado por Kangwa [1] (1,6 mg/g biomasa seca). El SDS-PAGE del eluído obtenido en la IMAC (Fig. 1B) demuestra una pureza >90% del producto en un solo paso de purificación (PM AviPure = 14 kDa).A B Fig. 1. A. Parámetros durante el cultivo de E.coli recombinante en bioreactor de 5 L. B. IMAC para la purificación de AviPure y SDS-PAGE del producto purificado (calle 1) y del marcador de peso molecular (calle 2) de 60, 45 y 14,4 kDa.ConclusiónProteínas recombinantes simil proteína A, como el AviPure, tienen una gran demanda por sus propiedades de unión a IgGs. En este trabajo se muestra un proceso de fermentación optimizado a escala piloto para la obtención de esta proteína en el orden de gramos, con un grado de purificación suficiente para aplicaciones en diagnóstico y preparación de matrices cromatograficas de afinidad. Referencias[1] Kangwa et al (2015). AMB expr 5 (70).[2] Kikot et al (2014). J Mol Recognit 27(11). 659-68.[3] Riesenberg et al (1990). Appl Microbiol Biotechnol (34) 77-82

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