Escalado de la producción de un marcador molecular en el tratamiento de la Enfermedad de Chagas: proteína F29 recombinante

BRITOS, C.; SEBASTIAN CABALLITO; CARLOS PRAVIA; ELSA VELAZQUEZ; HUGO MASSALDI; A. RUIZ; MARIANO GRASSELLI

Buenos Aires

Congreso; X Congreso Argentino de Farmacia y Bioquímica Industrial; 2005

Asociacion Argentina de Farmacia y Bioquimica Industrial

La enfermedad de Chagas-Mazza, causada por el parásito Tripanosoma Cruzi, es prevalente en América Central y Sudamérica, con un total estimado de 18 millones de personas infectadas, de las cuales unos 2,5 millones se encuentran en Argentina.  Esta enfermedad es curable si se la trata  tempranamente (en fase aguda) mediante agentes como el Benznidazol.  El tratamiento presenta serias reacciones adversas, por lo cual es importante determinar cuanto antes y con precisión  el momento de la curación. La curación se determina por la ausencia de anticuerpos en sangre contra distintas formas del parásito, y por ello son importantes las características del test diagnóstico utilizado.  Nuevos test de ELISA de competencia que utilizan anticuerpos monoclonales han permitido diferenciar el Mal de Chagas de otras enfermedades parasíticas de reacción cruzada.  Estos test de ELISA en base a antígenos citoplasmáticos y flagelares recombinantes  presentan prácticamente un  100%  de especificidad y muy alta sensibilidad. Recientemente, el INP-ANLIS ha desarrollado un ensayo inmuno-enzimático  que utiliza como antígeno una proteína flagelar recombinante del T. cruzi, denominada  “F29”, la cual ha sido propuesta  como un marcador preciso de curación.  En el presente trabajo se presentan datos de la producción en escala piloto de la proteína recombinante F29. Esta proteína fue expresada en el sistema pQE32 que produce la proteína de forma intracelular y soluble con una secuencia terminal de His expresada en sistema procariótico E. coli M15.  De los medios de cultivo estudiados, la formulación mineral “Riesenberg” con 10 g/L de glucosa resultó adecuada para la realización de un cultivo en batch (1,5 L) llegándose a una DO600 nm de 14 (biomasa final de 4 g/L peso seco). Se estudiaron la lactosa y el IPTG como inductores de expresión. Solamente el IPTG en una concentración de 1 mM presentó un alto nivel de inducción. El tiempo de inducción fue ajustado a 2 h, mayores tiempos de inducción mostraron productos de degradación de la proteína inducida. La ruptura celular se realizó con un homogeneizador de alta presión Xpress a una concentración de 30 g/L de peso seco de biomasa. Se obtuvo un rendimiento del 70% de ruptura con tres pasajes. El sobrenadante, previamente clarificado por centrifugación, fue adsorbido en una columna Ni2+-IDA-Sepharose. Se realizó un gradiente de imidazol en escalones y la proteína de interés eluyó con 100 mM de imidazol. La columna cromatográfica fue escalada 10x y la fracción colectada fue diafiltrada por filtración tangencial con un modulo de 10 kDa MWCO y Liofilizada. Se obtuvieron 100 mg de F29 con una pureza del 90 %. En SDS-PAGE se observan dos bandas, correspondientes a la proteína de interés y un fragmento de degradación de la misma. La enfermedad de Chagas-Mazza, causada por el parásito Tripanosoma Cruzi, es prevalente en América Central y Sudamérica, con un total estimado de 18 millones de personas infectadas, de las cuales unos 2,5 millones se encuentran en Argentina.  Esta enfermedad es curable si se la trata  tempranamente (en fase aguda) mediante agentes como el Benznidazol.  El tratamiento presenta serias reacciones adversas, por lo cual es importante determinar cuanto antes y con precisión  el momento de la curación. La curación se determina por la ausencia de anticuerpos en sangre contra distintas formas del parásito, y por ello son importantes las características del test diagnóstico utilizado.  Nuevos test de ELISA de competencia que utilizan anticuerpos monoclonales han permitido diferenciar el Mal de Chagas de otras enfermedades parasíticas de reacción cruzada.  Estos test de ELISA en base a antígenos citoplasmáticos y flagelares recombinantes  presentan prácticamente un  100%  de especificidad y muy alta sensibilidad. Recientemente, el INP-ANLIS ha desarrollado un ensayo inmuno-enzimático  que utiliza como antígeno una proteína flagelar recombinante del T. cruzi, denominada  “F29”, la cual ha sido propuesta  como un marcador preciso de curación.  En el presente trabajo se presentan datos de la producción en escala piloto de la proteína recombinante F29. Esta proteína fue expresada en el sistema pQE32 que produce la proteína de forma intracelular y soluble con una secuencia terminal de His expresada en sistema procariótico E. coli M15.  De los medios de cultivo estudiados, la formulación mineral “Riesenberg” con 10 g/L de glucosa resultó adecuada para la realización de un cultivo en batch (1,5 L) llegándose a una DO600 nm de 14 (biomasa final de 4 g/L peso seco). Se estudiaron la lactosa y el IPTG como inductores de expresión. Solamente el IPTG en una concentración de 1 mM presentó un alto nivel de inducción. El tiempo de inducción fue ajustado a 2 h, mayores tiempos de inducción mostraron productos de degradación de la proteína inducida. La ruptura celular se realizó con un homogeneizador de alta presión Xpress a una concentración de 30 g/L de peso seco de biomasa. Se obtuvo un rendimiento del 70% de ruptura con tres pasajes. El sobrenadante, previamente clarificado por centrifugación, fue adsorbido en una columna Ni2+-IDA-Sepharose. Se realizó un gradiente de imidazol en escalones y la proteína de interés eluyó con 100 mM de imidazol. La columna cromatográfica fue escalada 10x y la fracción colectada fue diafiltrada por filtración tangencial con un modulo de 10 kDa MWCO y Liofilizada. Se obtuvieron 100 mg de F29 con una pureza del 90 %. En SDS-PAGE se observan dos bandas, correspondientes a la proteína de interés y un fragmento de degradación de la misma.