Expresión y purificación de una versión permeable de la subunidad catalítica de la toxina botulínica B

BENEGAS FABIANA CRISTINA; TOMES CN

Mendoza

Congreso; I CONGRESO INTERUNIVERSITARIO I+D+I MENDOZA; 2021

Universidad Nacional de Cuyo

Las SNAREs forman una superfamilia de proteínas que catalizan la fusión de membranas biológicas. La SNARE sinaptobrevina participa en la exocitosis, proceso por el cual las células liberan el contenido de sus vesículas secretoras hacia el exterior. Las toxinas botulínicas, sintetizadas por la bacteria Clostridium botulinum, ejercen selectivamente su actividad proteolítica sobre una unión peptídica en una proteína SNARE inhibiendo así la exocitosis. En este proyecto se puso a punto la expresión de la cadena liviana de la toxina botulínica B (BoNT/B: selectiva para sinaptobrevina) fusionada al péptido permeable TAT del virus del VIH a partir de un gen diseñado en el laboratorio y subclonado en un vector para expresión (pET28a) en Escherichia coli.La bacteria más utilizada para producir proteínas recombinantes es Escherichia coli. Se cultivaron sucesivamente dos cepas no patógenas de E. coli, la primera (top 10) optimizada para obtener plásmidos y la segunda (BL21DE3) para la expresión de proteínas foráneas. Ambas se hicieron quimiocompetentes con RbCl y un shock térmico para que acepten los plásmidos que se les ofrecen (en este caso, el que codifica para la BoNT/B permeable). A continuación se realizó la transformación de estas bacterias y se seleccionaron las que habían incorporado el plásmido recombinante utilizando un antibiótico de selección. De estas colonias se prepararon y se conservan stocks. Se purificó plásmido de la cepa top 10, se le midió la concentración en Nanodrop y se corrió en gel de agarosa teñido con SybrGreen. Con este plásmido se transformó E. coli cepa BL21DE3; se guardaron stocks a partir de colonias resistentes al antibiótico de selección.Luego de esto se realizó la puesta a punto de la expresión de la toxina en cultivos pequeños de E. coli BL21DE3, modificando las variables tiempo, temperatura y concentración de IPTG. Éste es un análogo no hidrolizable de la lactosa que actúa como inductor al unirse al promotor del operón lactosa presente en el plásmido recombinante pET28a. Llevada a cabo la inducción y producción de la toxina, la His₆-TAT-BoNT/B se purificó por cromatografía de afinidad en Ni-NTA-agarosa en batch. Cada fracción de cada protocolo de inducción se analizó por electroforesis en geles de poliacrilamida al 10 % en condiciones desnaturalizantes seguida de tinción con azul de coomassie. La expresión óptima (mayor abundancia, menor contaminación, mejor elución de la resina) se logró induciendo con 0,1 mM de IPTG toda la noche a 22˚C.Una vez seleccionadas las condiciones de inducción, se escalaron a cultivos de 250 ml para producir y purificar la proteína por cromatografía de afinidad en una columna His-trap. Se eluyeron numerosas fracciones conteniendo His₆-TAT-BoNT/B con un nivel > 90 % de purificación. A futuro se desea seguir con el proyecto coincubando la toxina producida con espermatozoides humanos. Dado que estas células no realizan endocitosis, toda proteína que ingrese lo hará ?transducida? por el péptido TAT. Con esta herramienta se profundizarán estudios previos sobre el papel de la sinaptobrevina durante la exocitosis acrosomal. Además, la toxina será de utilidad para avanzar en el conocimiento de las vías de señalización que conducen a la exocitosis regulada.