Secuenciación del genoma completo de dos aislamientos de Corynebacterium bovis provenientes de ovinos Merino con Lana Sisal de la Patagonia Argentina

ABDALA A.; GONZALEZ S; VERA, P.; ANDREA PUEBLA; FARBER MD; ROBLES C

Rosario

Congreso; ALAM; 2016

Asociación Argentina de Microbiología

La Lana Sisal es una dermatitis infecciosa que afecta a ovinos de raza Merino y se caracteriza por manchones oscuros y deprimidos en el vellón con las fibras aglutinadas (Robles, 2007). De hisopados de piel se ha aislado en forma consistente una bacteria corineforme que fue identificada por secuenciación del 16S ARNr como Corynebacterium bovis (C. bovis). C. bovis es una bacteria Gram positiva, y lipofílica, causal de mastitis clínica y subclínica en vacas (Watts y col. 2000). En este trabajo se reporta la secuenciación genómica de C. bovis 2AM y 5AM, dos aislamientos de ovinos con Lana Sisal, y su comparación con el genoma de la cepa de referencia C. bovis DSM 20582 (Schröder y col. 2012) aislada de ubre bovina (Brooks & Barnum 1984).Se extrajo ADN genómico de 1AM y 5AM utilizando el kit DNeasy (QUIAGEN), se construyeron librerías de extremos pareados ( Paired End) y se secuenciaron mediante Illumina Miseq, obteniéndose un total de 3056444 y 2470580 de lecturas para 1AM y 5 AM, respectivamente. La secuenciación de C. Bovis 1AM arrojó un total de 3056444 lecturas y la de 5 AM 2470580, resultando en una cobertura mayor a 250X en ambos casos. Las lecturas se cortaron por calidad y por presencia de adaptadores. Se realizó un ensamblado de novo utilizando Flash, Celera y Spades. los ensamblados obtenidos Se se alinearon con MUMmer los ensamblados obtenidos contra el de DMS 20582, y se realizó el anotado de los genomas utilizandoSe realizó la anotación automática mediante RAST. Para el análisis de la variación genética se realizó una la búsqueda de SNPs utilizando VarScan contra el genoma de referencia, utilizando como criterio una cobertura mínima de 15 lecturas y un 90% de presencia de la variante.. Se mapearon las lecturas de 1AM y de 5AM contra el genoma de referencia. Luego se definieron SNPs como posiciones variantes con una cobertura mínima de 15 lecturas y con un 90% de presencia de la variante. Se obtuvieron 29 y 50 scaffolds para 1AM y 5AM respectivamente, para un total de cubriendo 2,6 Mb en ambos aislamientos para 1AM y 5AM. El contenido de GC fue del 73% para ambos, similar al reportado,equivalente al reportado para en el genoma de referencia de 72,5%. El gráfico de Los Dot-Plot (NucMer) mostraron mostró una buena concordancia con el genoma de referencia, visualizándose pocas áreas repetitivas en los ensamblados logrados. El cálculo del ANI (Identidad Nucleotidica Promedio) comparando 1AM y 5AM con DMS 20582 fue de 98,5% en ambos casos y comparando los aislamientos de ovinos entre sí de 99,5%, corroborando que las tres cepas corresponden a la misma especie. La predicción de genes arrojó En el genoma de 2196 regiones codificantes para 1AM se encontraron 2196 regiones codificantes, 2087 en el dparae 5AM 2087 y mientras que están reportados en el de referencia 1987 para DMS 20582. Comparando los SNPs obtenidos, se observa que el 88% de los SNPs hallados en 5AM respecto a DMS 20582 son idénticos a los hallados en 1AM. Esto indica que una alta proporción de las variaciones respecto a la cepa de referencia son compartidas entre los aislamientos de ovinos.El protocolo de ensamblado utilizado permitió generó generar un menor número de contigs que el genoma de la cepa de referencia (N=503) en ambos casos (29 y 50), en un genoma que contiene un alto contenido de GC, lo que se refleja en un aumento de genes predichos. Si bien por unla clasificación previa a través de la secuencia análisis del gen del 16S ARNr indicaba la pertenencia de los aislamientos corresponden a la misma especie C. bovis, este estudio genómico logró establecer la existencia de variabilidad entre cepas de C. bovis aisladas de ovinos con Lana Sisal y la cepa de referencia bovina que causa mastitis en vacas. El hecho de que 1AM y 5AM sean genéticamente más similares entre sí que al respecto al aislamiento de bovino bovino, sugiere la asociación de variantes específicas de C. bovis de acuerdo al hospedador sugiere que el hospedero en la cual se encuentra C. bovis influye en su proceso de evolución genética.