DESARROLLO DE UNA MEMBRANA PARA LA DETECCIÓN SIMULTÁNEA DE DIFERENTES ESPECIES DE ENTAMOEBA EN HECES DE ANIMALES A TRAVÉS DE LA METODOLOGÍA DE HIBRIDIZACIÓN REVERSA EN LINEA

LOPEZ-ARIAS L; PAOLETTA M; JARAMILLO ORTIZ JM; GUILLEMI E; GARBOSSA G.; FARBER MD

Buenos Aires

Congreso; XIII Congreso Argentino de Microbiología y II Congreso Microbiología Agrícola y Ambiental 2013; 2013

Asociación Argentina de Microbiologia

P-103 DESARROLLO DE UNA MEMBRANA PARA LA DETECCIÓN SIMULTÁNEA DE DI- FERENTES ESPECIES DE Entamoeba EN HECES DE ANIMALES A TRAVÉS DE LA METODOLOGÍA DE HIBRIDIZACIÓN REVERSA EN LINEA L López Arias1 2, M Paoletta1, JM Jaramillo Ortiz1, E Guillemi1, G Garbossa2 3, M Farber1 1 Instituto de Biotecnología, INTA., Argentina. 2 Departamento de Química Biológica, FCEN, Universidad de Buenos Aires., Argentina. 3 Instituto de Investigaciones en Salud Pública, Universidad de Buenos Aires., Argentina. El diagnóstico de amebiasis se lleva a cabo, rutinariamente, por identifi- cación microscópica de Entamoeba spp. en heces o incluso en tejidos. Sin embargo, la microscopía óptica no es suficiente para realizar el diagnóstico diferencial de todas las especies que pertenecen a este grupo. En particular, E. histolytica, E. dispar y E. moshkovskii son morfológicamente indistingui- bles y, el empleo de esta metodología sólo permite asegurar el diagnósti- co de género. De hecho, la sensibilidad puede disminuir hasta el 60% sobre todo cuando operadores inexpertos confunden ciertos tipos celulares poco frecuentes con trofozoítos y quistes, o bien diagnostican erróneamente las especies.Frente a esta problemática, se han diseñado diferentes métodos que permiten la detección e identificación correcta de diferentes especies de este parásito (utilización de anticuerpos, coproantígenos, genotipifica- ción). Algunas de estas herramientas solo permiten la detección de ciertas especies más relevantes, subestimando otras. Y en el caso de la genotipi- ficación este método es costoso.En este trabajo se propone el desarrollo y puesta a punto de una metodología de hibridización reversa en línea para la detección e identificación simultánea de diferentes especies de Entamoeba que parasitan tanto al hombre como animales. Para ello se diseñaron oli- gonucleótidos especie-especifico (sonda) de Entamoeba a partir de las se- cuencias disponibles en GenBank del gen 18S del ARN ribosomal de una región con suficientes polimorfismos que permitiera distinguir entre especies. Los oligonucleótidos tienen la modificación 5? que permite la unión covalente a la membrana en sentido transversal a la línea donde se sembrará posterior- mente el producto de amplificación. Por otro lado, se realizaron dos pasos de PCR utilizando cebadores que hacen blanco en una región conservada del mismo gen. A su vez estos cebadores se encuentran conjugados a biotina, lo que permite la detección de la señal de hibridación positiva a través de una reacción de detección acoplada (quimioluminiscencia). Este método permi- te procesar hasta 40 muestras de manera simultánea. Las muestras utiliza- das fueron heces de animales procedentes de una región Chaqueña. El diseño y desarrollo de esta membrana permitió la detección e identificación de la especie E. polecki, la cual había sido determinada anteriormente por PCR- secuenciación, como así también las especies E. bovis y E. moshkovskii. La metodología aquí propuesta resultó ser una herramienta sensible para la de- tección de estos enteroparásitos ya que pudieron identificarse al menos una especie de Entamoeba en muestras que habían sido diagnosticadas como negativas por microscopía y se determinó, en otros casos, la coexistencia de especies. Del mismo modo resulto ser una herramienta muy útil tanto para la exploración de nuevas especies (crípticas) como para aquellas no reporta- das en esa región hasta el momento.