Estudio de la familia de proteínas del tipo Perforina de Babesia bigemina a partir de la información disponible en organismos relacionados del phylum Apicomplexa.

PETRIGH R; NATALIA REGO; VALENTINI B; SORIA M; NAYA H; ROMERO H; ECHAIDE I; FARBER M

Mar del Plata

Congreso; IX Congreso Argentino de Protozool ogía y Enfermedades Parasitarias; 2011

Sociedad Argentina de Protozoologia

Los protozoarios intraeritrocitarios pertenecientes al phylum Apicomplexa: Babesia bovis y Babesia bigemina son los agentes causales de la babesiosis bovina, una enfermedad transmitida por la garrapata Rhipicephalus microplus que provoca importantes pérdidas económicas a la ganadería bovina en áreas enzoóticas. Durante la última década, la comprensión de la biología de los parásitos del phylum Apicomplexa ha aumentado notablemente, en gran parte debido a la disponibilidad del genoma completo, a los perfiles transcriptómicos y proteómicos y al establecimiento de nuevas técnicas de transfección in vitro. A pesar de su importancia económica los parásitos transmisores de la babesiosis bovina, han sido relativamente ignorados. En este trabajo se plantea aportar herramientas para desentrañar los mecanismos moleculares que subyacen en la patogenia de la babesiosis a partir de lo reportado en Plasmodium spp. y Toxoplasma gondii. Las proteínas del tipo perforinas son componentes ancestrales del repertorio de proteínas involucradas en la interacción patógeno-hospedador por contener el dominio de ataque a membrana (MACPF). Este dominio ha sido inicialmente caracterizado en mamíferos (C6-C9 del sistema del complemento y las perforinas de los linfocitos T-citotóxicos). En el género Plasmodium ha sido reportada una  familia de cinco proteínas del tipo Perforina (Perforin- like protein –PLP-) que poseen el dominio MACPF (1)  y en T. gondi,  dos proteínas con dominio MACPF que están  involucradas en el egreso del parásito de la célula huésped (2). El objetivo de este trabajo fue identificar y caracterizar esta familia de proteínas en Babesia bigemina. Dado que el ensamblado y la anotación del genoma de B. bigemina aún no se ha concluido, utilizamos herramientas in silico y moleculares para completar una anotación curada de los genes plp. Teniendo en cuenta la información de los genomas anotados de otros apicomplejos relacionados y la utilización de algoritmos y servidores desarrollados para su análisis y anotación de genes,  hemos anotado una familia de ocho genes de B. bigemina que codifican para proteínas con dominio MACPF que poseen en su mayoría una secuencia de exportación a membrana. Todos los dominios MACPF de Babesia presentaron los elementos fundamentales para la formación del poro, con distinto grado de similitud secuencial, entre mamíferos, bacterias y otros apicomplejos. En cuanto a la estructura secundaria, la conservación es mayor principalmente en las estructuras fundamentales para que la proteína se inserte en la membrana blanco. Esta conservación nos permitió modelar la estructura tridimensional del dominio MACPF de las proteínas PLPA y PLPB de B. bigemina a partir de su homología con el dominio MACPF de la proteína cristalizada del complemento humano (C8-MACPF). Asimismo, se identificó en los genes plpa de B. bigemina y B. bovis una región de repeticiones en tándem en la porción 5’. Estas regiones resultaron ser polimórficas tanto en B. bovis como en B. bigemina en distintas cepas de estos parásitos. .   En este trabajo reportamos una nueva disposición de dominios MACPF en el orden Piroplasmida (Babesia y Theileria), demostrando la presencia de una proteína de tres dominios en B. bovis y T. annulata y dos proteínas adicionales con dominio único en B. bigemina y T. parva. El análisis filogenético de los dominios de las PLPs de Haemosporida (Plasmodium) y Piroplasmida demostró que la evolución de la familia fue paralela a la evolución de las especies en estos ordenes. La reconstrucción filogenética de los dominios MACPF permitió plantear como hipótesis que ocurrieron a lo largo de la evolución varios eventos de pérdida y duplicación linaje-especificas que dieron origen a los distintos miembros en Haemosporida y Piroplasmida. Además, existieron eventos de duplicación y fusión que dieron origen a la PLP con tres dominios MACPF en B. bovis y T. annulata A partir del análisis transcripcional de los genes de la familia plp demostramos que todos los genes se transcriben en el estadio intraeritrocitario tanto en B. bigemina como en B. bovis. Sin embargo, los resultados del análisis de los niveles transcripcionales en el estadio intraeritrocitario de B. bigemina  por qRT-PCR, indicaron un aumento en la tasa transcripcional de los genes plpe y b destacando una función importante de las proteínas correspondientes en el estadio intraeritrocitario del parásito. Adicionalmente, se observó la expresión de la proteína PLPA en el estadio intraeritrocitario de B. bigemina por Inmunofluorescencia indirecta, utilizando anticuerpos de ratones inmunizados con la proteína recombinante PLPA. Estos resultados sumados al reconocimiento de esta proteínas por parte de los sueros bovinos provenientes del área enzoótica para la babesiosis, a la presencia del péptido señal en su secuencia y a la identificación de repeticiones en tándem variables en distintas cepas del parásito, sugieren que esta proteína es exportada a la membrana del parásito en la cual formaría el poro. La proteína PLPA en la membrana podría ser reconocida por el sistema inmunológico. Aunque, la presencia de repeticiones variables entre cepas podría estar derivando la respuesta inmune hacia una respuesta ineficaz T-independiente, evitando la generación de una alta respuesta inmunológica contra el dominio MACPF cuya función sería importante para la invasión del parásito a nuevos eritrocitos. Si bien los mecanismos de formación del poro por proteínas con dominio MACPF han sido ampliamente descriptos, el estudio de estas proteínas en Apicomplexa provee nuevos conceptos que definen nuevos roles en la interacción del parásito con su hospedador y con el vector transmisor. Los rearreglos inusuales de dominios en B. bovis y T. annulata podrían representar un nuevo arreglo estructural que determine un modo de acción diferente del dominio MACPF.   Citas bibliográficas   (1) Kaiser K, Camargo N, Coppens I, Morrisey JM, Vaidya AB, Kappe SH. (2004) A member of a conserved Plasmodium protein family with membrane-attack complex/perforin (MACPF)-like domains localizes to the micronemes of sporozoites. Mol Biochem Parasitol 133 (1): 15-26. (2) Kafsack BF, Pena JD, Coppens I, Ravindran S, Boothroyd JC, Carruthers VB. (2009) Rapid membrane disruption by a perforin-like protein facilitates parasite exit from host cells. Science 323 (5913): 530-3.