Desarrollo de un esquema de tipificación por secuenciación de locus múltiples (mlst) para hemoparasitos bovinos.

E. GUILLEMI; P. RUYBAL; S. DELFINO; D. PRINCIPI; M. FARBER; S. WILKOWSKY

Mercedes, Corrientes

Encuentro; XVIII Reunión Científico Técnico de la Asociación Argentina de Veterinarios de Laboratorios de Diagnostico; 2010

Asociación Argentina de Veterinarios de Laboratorios de Diagnostico

DESARROLLO DE UN ESQUEMA DE TIPIFICACIÓN POR SECUENCIACIÓN DE LOCUS MÚLTIPLES (MLST) PARA HEMOPARASITOS BOVINOS. E. Guillemi1, P. Ruybal1, S. Delfino1, D. Príncipi1, P. Zimmer2, B. Cetra2, N. Sarmiento2,  M. Farber1, S. Wilkowsky1 1. Instituto de Biotecnología, Centro de Investigaciones de Ciencias Veterinarias y Agronómicas, Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), Castelar, Buenos Aires, Argentina. eguillemi@cnia.inta.gov.ar 2 INTA, EEA - Mercedes, Corrientes, Argentina Introducción: La babesiosis causada por los protozoarios Babesia bovis y Babesia bigemina y la anaplasmosis causada por la rickettsia Anaplasma marginale, son enfermedades hemoparasitarias de los bovinos que causan importantes pérdidas económicas a la ganadería bovina. El noreste argentino (NEA) es la segunda región en orden de importancia con respecto a la distribución del rodeo nacional y es además un área enzoótica para estas enfermedades dado que allí se encuentra la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus, la cual está involucrada en la transmisión de los tres hemoparásitos al ganado bovino e infesta unas 60 millones de has. El área de anaplasmosis enzoótica es mayor y se extiende hasta el paralelo 33°S, con 22.600.000 bovinos afectados debido a que A. marginale es transmitido además mecánicamente por insectos hematófagos y agujas hipodérmicas (1). Por todo lo dicho es que resulta imprescindible establecer la situación epidemiológica de estos hemoparásitos a fin de predecir el riesgo de ocurrencia de casos clínicos, aplicar medidas de control estratégico, analizar la estructura poblacional de estos parásitos, realizar seguimientos exhaustivos de fallas vacunales y monitorear a nivel genético la producción de vacunas vivas. En nuestro país el estado del conocimiento respecto de la diversidad de genotipos de A. marginale, B. bovis y B. bigemina es muy escaso. El objetivo de este trabajo fue desarrollar un esquema de MLST para los tres hemoparásitos a fin de estimar la estructura poblacional y la diversidad genotípica de aislamientos de distinto origen. La tipificación por secuenciación multilocus (MLST) fue propuesta por primera vez en 1998 para investigaciones epidemiológicas de patógenos bacterianos y también para estudios evolutivos y poblacionales (2). En el análisis por MLST, se seleccionan 6 a 7 genes con funciones metabólicas conservadas, los cuales se amplifican por PCR y se secuencian, se le asigna un número de alelo a todas las secuencias únicas para un determinado locus. Los números de los alelos presentes en cada locus del MLST para un determinado aislamiento se combinan en un perfil alélico definido por un nuevo número, el cual es llamado haplotipo o “tipo secuencial” (ST). Estos datos se aplican a análisis filogenéticos y se establecen así las relaciones parentales. Materiales y Métodos: Se llevó a cabo un análisis in silico del genoma anotado de B. bovis (cepa T2Bo, Texas, EEUU, http://www.vetmed.wsu.edu/research_vmp/babesia-bovis) y se seleccionaron 23 genes de copia única, distribuidos en los 4 cromosomas del parásito y correspondientes a proteínas hipotéticas anotadas con funciones conservadas. Para B. bigemina se identificaron 20 genes por TBLASTN contra los contigs del genoma utilizando como consulta los genes ortólogos de B. bovis. Para la selección de genes candidatos en A. marginale se tuvo en cuenta su aplicación en esquemas de MLST para otros microorganismos descriptos en bibliografía previa (3 y 4). Con esta premisa se seleccionaron inicialmente 14 genes codificantes para proteínas conservadas, de copia única y con una distribución homogénea en el genoma de la bacteria. Sobre estos genes se diseñaron iniciadores utilizando el programa Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/), buscando amplificar un fragmento de entre 500 a 700 pb. que permitiera la obtención de secuencias en ambas hebras de alta calidad y teniendo en cuenta una temperatura de annealing única de manera tal de poder procesar todas las reacciones en forma simultánea. Se probaron estos iniciadores y se seleccionaron entre 6 y 7 genes para cada hemoparásito en base a: cantidad de sitios polimórficos; distribución en el genoma, ausencia de presión selectiva (dN/dS <1) y especificidad de los oligonucleótidos frente a ADN heterólogo. Los genes seleccionados fueron 7 para B. bovis (check, dnaJ, gpad, pkid, rcc, rip9 y rho4), 6 para B. bigemina (cyp, dnaJ, rcc, sbp3, sbp4 y zfc) y 7 para A. marginale (dnaA, ftsz, groEl, lipA, recA, secY y sucB). Se estudiaron 5 aislamientos previamente caracterizados de B. bovis, 2 casos clínicos agudos y la cepa del proyecto genoma (T2Bo). Para B. bigemina se analizaron 7 cepas de referencia argentinas, 2 cepas de referencia extranjeras, 1 caso agudo más un pasaje del mismo en garrapata y ternero esplenectomizado y la cepa australiana virulenta del proyecto genoma, y para A. marginale se estudiaron 5 secuencias genómicas disponibles (Saint Marie, Mississippi, Puerto Rico, Florida y Virginia), 5 aislamientos argentinos de referencia, 2 aislamientos de E.E.U.U y 26 aislamientos de campo del norte argentino. Las secuencias concatenadas (6 o 7 genes) se sometieron a reconstrucción filogenética por el método Neighbor-Joining, Kimura-2-parámetros (MEGA 3.1). Resultados: Los resultados obtenidos mostraron que existen 8 STs para los 8 aislamientos de B. bovis analizados, es decir que la tasa de genotipos multilocus para la población de este parásito fue igual a 1. Como resultado del análisis de las secuencias concatenadas de B. bigemina se obtuvieron 9 STs diferentes para los 12 aislamientos estudiados. El dendograma mostró dos grupos bien definidos para las cepas de origen argentino que agruparon a aquellas de carácter patógeno separadas de las atenuadas. Si bien las cepas no argentinas no se agruparon junto con las locales, la cepa atenuada extranjera se mantuvo en el mismo clado que las atenuadas argentinas, en cambio la patógena extranjera permaneció en el clado correspondiente a las patógenas. Para el caso de A. marginale el análisis de los dendogramas sugirió la existencia de eventos de recombinación intragénica, lo que fue posteriormente confirmado utilizando el test de Máximo Chi Cuadrado. De acuerdo con estos resultados se decidió aplicar un estudio de asociación de STs utilizando el software eBurst V3 (http://eburst.mlst.net/). Como resultado de este análisis se obtuvieron tres grupos, dos de los cuales se constituyeron con un ST fundador. Uno de estos dos grupos se conformó con STs de aislamientos norteamericanos y el otro con STs de aislamientos argentinos. Estos grupos no incluyeron 7 de los 35 STs obtenidos pudiendo deberse a la dispersión geográfica de los aislamientos. Discusión: En vista de estos resultados podemos concluir que el empleo de la técnica de MLST para B. bigemina y A. marginale es una herramienta útil para la discriminación de aislamientos de distinto fenotipos y origen geográfico, y que su utilización a mayor escala con muestras de campo permitirá obtener información acerca de la distribución espacial de los genotipos presentes en nuestro país. En relación a los resultados obtenidos para B. bovis y teniendo en cuenta que el tamaño muestral es pequeño, no se puede descartar que se detecten asociaciones luego de analizar un número mayor de muestras. Bibliografía 1-Hawkins JA. et.al. 1982. Mechanical transmission of anaplasmosis by tabanids (Diptera: tabanidae). Am. J. Vet. Res, v43:732-734. 2-Maiden MC. et. al. 1998. Multilocus sequence typing: a portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms. PNAS, v95:3140-3145. 3- Vitorino L. et. al. 2007. Rickettsiae phylogeny: a multigenic approach. Microbiology, v153:160–168. 4- Jacobson MJ. et. al. 2008. Phylogenetic analysis of Clostridium botulinum type A by multi-locus sequence typing. Microbiology, v154: 2408–2415.