Cultivo a largo plazo de linfocitos B bovinos

FORLETTI AGUSTINA; RODRIGUEZ D; DOLCINI GUILLERMINA; CERIANI CAROLINA; GUTIERREZ SE

Huerta Grande, Cordoba

Jornada; VIII Jornadas de actualizacion de la Sociedad Argentina de Virologia; 2009

Sociedad Argentina de Virologia

Los linfocitos B (LB), su desarrollo, diferenciación y función son un área primordial de investigación para entender la biología y patología de enfermedades que afectan el sistema inmune de vertebrados.El virus de la leucosis bovina (BLV) es un retrovirus que infecta LB y genera desórdenes linfoproliferativos. Este virus alcanza altas prevalencias en nuestro país, generando importantes pérdidas económicas, principalmente en rodeos lecheros. Se ha encontrado que determinados alelos del gen BoLA DRB3.2 confieren resistencia a la diseminación del BLV, sin embargo se desconoce el mecanismo subyacente a dicha resistencia.El estudio de la interacción entre el BLV y su célula hospedadora ha sido llevado a cabo en modelos in vitro cultivando linfocitos B ovinos. Para el cultivo a largo plazo de estas células se ha empleado la coestimulación con el ligando de CD40 (CD40L) y citoquinas como IL-2 e IL-4. Sin embargo el modelo ovino, tanto in vivo como in vitro, presenta algunas limitaciones por no ser el huésped natural del BLV. En cuanto al sistema bovino, no se han reportado cultivos de linfocitos B por períodos mayores a 7 días.El objetivo de este trabajo fue establecer un método para obtener cultivos a largo plazo de linfocitos B bovinos portadores de alelos definidos del gen BoLA DRB3.2. Estos cultivos serán utilizados como modelo para estudiar la interacción del BLV con su célula blanco natural.Se seleccionó una vaca Holando Argentino BLV-negativa, homocigota para el alelo *1501 del gen BoLA DRB3.2. Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica (CMSP) mediante centrifugación en gradiente de Ficoll-Hypaque a partir de 60 ml de sangre del animal donante. Se empleó una monocapa de células L4.5 como fuente de CD40L. Se ajustó la concentración de Mitomicina C (MMC) para detener la división celular de las mismas en tratamientos de 16hs. Cuatro millones de CMSP se cultivaron en IMDM con 10% de SFB sobre una monocapa de células L4.5 previamente tratada con MMC. Se adicionó al cultivo IL-2 (10ng/ml), β-Mercaptoetanol (20μM) y Anfotericina B (0.25μg/ml). Se renovó el medio de cultivo y la monocapa de L4.5 cada 4 ó 5 días. Se determinó la viabilidad y concentración celular en intervalos regulares. La proporción de LB en el cultivo se analizó mediante citometría de flujo.La dosis óptima de MMC establecida para detener el crecimiento de las células L4.5 utilizadas como feeder-layer fue de 0.8μg/ml. Durante la primer semana de cultivo de las CMSP se observó un descenso en la concentración celular hasta 2.6 x106cél/ml, manteniéndose la viabilidad en 80%. Estos valores se conservaron durante 23 días de cultivo. A los 37 días se determinó que el 95% de las células eran positivas para IgM de superficie (mIgM+) y que sólo el 2% eran positivas para IgG de superficie.La metodología de cultivo empleada coestimulando las CMSP con CD40L y citoquinas resultó en una selección de células B mIgM+ luego de 37 días de cultivo