DESARROLLO DE UNA METODOLOGÍA PARA LA DETERMINACIÓN DE LA CARGA ALÉLICA DE LA MUTACIÓN JAK2 V617F

CARDOZO MA; PADUÁN B; ROSSETTI MF; RAMOS JG; BOSQUIAZZO VL

Congreso; III Congreso de Bioquímica del Litoral.; 2015

Mutaciones en el gen JAK 2 fueron detectadas inicialmente en síndromesmieloproliferativos crónicos (SMPc) más específicamente en SMPc bcr/abl negativos. Lamutación más frecuente observada es G1849T en el exón 14 que resulta en la sustituciónV617F en la proteína (JAK 2 V617F), dando origen a una proteína con actividad tirosinaquinasa constitutiva. Algunos trabajos han demostrado bajos porcentajes (1-3%) de lamutación en individuos sanos lo que sugieren que la misma puede estar presente antes deque se desarrolle el cáncer. Esto crea la necesidad de contar con métodos cuantitativossensibles y precisos para su detección. En el presente trabajo nos propusimos desarrollaruna metodología que permita la determinación cuantitativa de la carga alélica de lamutación JAK 2 V617F (porcentaje de alelos JAK 2 V617F/ total alelos JAK 2 ) utilizando unametodología de PCR alelo específica en tiempo real. Para ello se estudió la secuencia delgen JAK 2 y se diseñaron pares de oligonucleótidos determinando las mejores características termodinámicas y discriminatorias entre JAK 2 y JAK 2 V617F, agregando ungap sustitutivo purina-pirimidina en la posición -2 de cada oligonucleótido con el objetivode aumentar la astringencia de la reacción. Mediante la técnica de fenol-cloroformo-alcoholse extrajo ADN genómico de una muestra de sangre periférica de una persona sana y de lalínea celular establecida HEL proveniente de eritroleucemia humana, portante homocigotade la mutación JAK 2 V617F. Con los oligonucleótidos diseñados para el gen JAK 2 y usandocomo molde el ADN extraído de sangre periférica se obtuvo el amplímero de JAK 2 . Conlos oligonucleótidos diseñados para el gen JAK 2 V617F y usando como molde el ADNextraído de la línea celular se obtuvo el amplímero de JAK 2 V617F. Los amplímerosobtenidos se clonaron direccionalmente en vectores plasmídicos, denominándose pWT ypM, respectivamente. Los plásmidos se linealizaron y se determinaron sus concentracionespor espectrofotometría. Con el objetivo de determinar cuál es la mejor matriz molecularpara validar la técnica se realizaron diferentes tipos de curvas de calibrado: a) curvaconstruida con cantidades decrecientes de ADN genómico de paciente sano sobre unaconcentración constante de pM, b) curva construida con cantidades decrecientes de pM enuna cantidad constante de ADN genómico. Los parámetros obtenidos para estas fueron:curva a, pendiente= (-2,87), eficiencia= 125%, límite de detección: 11% de alelosJAK 2 V617F; curva b, pendiente= (-3,19), eficiencia= 105%, límite de detección: 1% dealelos JAK 2 V617F. Para la futura determinación de la carga alélica en muestras de sangreperiférica se recomienda utilizar curvas de calibrado construida con diluciones de pM sobreuna matriz de DNA genómico normal constante. Los resultados obtenidos demuestran quela metodología desarrollada es capaz de detectar bajas cargas alélicas de JAK 2 V617F (1%)con alto poder discriminativo, lo que permitirá la detección temprana de la mutación enindividuos sanos, como así también la evaluación de respuestas a acciones terapéuticas endistintas patologías oncológicas.