Determinación de sexo fetal en plasma materno

GAYDOU L; FOLLONIER A; BOSQUIAZZO VL; RAMOS JG

Congreso; III Congreso de Bioquímica del Litoral.; 2015

A partir del descubrimiento de la presencia de ADN fetal libre en sangre materna, eldiagnóstico prenatal no invasivo se ha convertido en un área de gran interés clínico y seencuentra en pleno desarrollo. La importancia de la determinación del sexo fetal en etapastempranas de la gestación radica en la posible detección de patologías hereditariasasociadas al cromosoma X ó Y, o la posibilidad de virilización del embrión con déficit de21-Hidroxilasa, lo que permitirá al médico brindarle al paciente la consejería genéticaadecuada. La determinación de sexo en sangre materna se realiza evaluando la presencia decromosoma Y. Un resultado positivo indica que el sexo del feto es masculino, en tanto queun resultado negativo nos indica que el feto es femenino. Para realizar estasdeterminaciones es necesario contar con métodos sensibles que permitan detectar bajascantidad de ADN fetal en plasma materno. En nuestro país, son escasos los centros querealizan estas determinaciones, lo que conlleva a que se deriven las muestras al exterior ylos costos sean elevados.En el presente trabajo nos propusimos desarrollar oligonucleótidos específicos y unatécnica sencilla para la detección, por PCR, de sexo fetal en plasma materno.Para ello se utilizaron plasmas de mujeres embarazadas (entre las semanas 13 y 36 degestación) obtenidos con EDTA. Como controles positivos y negativos se utilizaronmuestras de plasma de hombres y mujeres no embarazadas, respectivamente. Las muestrasse conservaron a -20°C hasta su procesamiento. El ADN libre se extrajo con las columnasQIAamp DNA blood Mini kit (QIAGEN). Mediante estudios bioinformáticos y utilizandoun software adecuado se diseñaron diferentes oligonucleótidos específicos para la deteccióndel cromosoma Y. Se seleccionaron tres pares de oligonucléotidos en función de suscaracterísticas termodinámicas, dos de los pares seleccionados amplifican diferentesregiones del gen SRY (uno desde la base 4847 a la 4983, y el otro desde la 5305 a la 5422)y el tercer par amplifica una región del gen DYS14. Se pusieron a punto las PCR utilizandolos oligonucleótidos diseñados. La especificidad de los amplicones obtenidos secorroboraron por curvas de disociación y posteriormente se verificó el peso molecular delos amplicones mediante corridas electroforéticas en geles de agarosa. Luego, se evaluaronlas muestras de ADN libre de mujeres embarazadas y los amplicones obtenidos sesometieron a electroforesis sobre geles de agarosa. Cuando las PCRs se realizaronutilizando los oligonucelotidos para amplificar SRY (4847-4983) y DYS14, se observaronbandas específicas en la muestras de ADN libre que provenían de embarazadas de fetomasculino (confirmado por ecografía) mientras que no se observaron bandas en lasmuestras de embarazadas de fetos femeninos. Los resultados obtenidos utilizando losoligonucleótido SRY (4847-4983) y DYS14 en las muestras evaluadas en el 2° y 3°70trimestre de gestación demuestran 100% de especificidad. La utilización de un doble target(SRY y DYS14) en la técnica desarrollada asegura una alta especificidad, próximamentedeterminaremos cuál es el momento más temprano del embarazo en el cuál se puedadetectar ADN fetal utilizando esta metodología.