DESARROLLO DE UNA PLATAFORMA TECNOLÓ- GICA DE INMUNO-PCR (IPCR) APTA PARA LA DETERMINACIÓN DE HORMONAS DE INTERÉS CLÍNICO

ABUD J; SANTAMARÍA C; RAMOS JG; MUÑOZ DE TORO M; LUQUE EH; RODRÍGUEZ HA

Congreso; LVIII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica (SAIC); 2013

Mediante la utilización de sondas de ADN reportera, la IPCRcombina la versatilidad del ELISA con la PCR como sistema deamplificación de la señal. En consecuencia, el límite de detecci ón(LD) de la IPCR es entre 100-10.000 veces mayor que el de unELISA homólogo por el uso de la PCR como un sistema de amplificaciónde señal. El objetivo general consiste en el desarrollo desistemas diagnósticos de interés clínico basados en ensayos deIPCR. Para optimizar esta plataforma tecnológica, en una primeretapa diseñamos un ensayo de IPCR para la proteína glutatión-S-transferasa (GST) de Schistosoma japonicum. Para ello, seobtuvieron 21 líneas de hibridomas productores de anticuerposanti-GST, tres de las cuales fueron seleccionadas para el procesode clonado. Se amplificaron diferentes clones en cultivos in vitroa escala de laboratorio y se obtuvieron anticuerpos monoclonales(mAbs) anti-GST purificados por cromatografía de afinidad aproteína G. Para la obtención de sondas de ADN biotiniladas sellevaron a cabo reacciones de PCR de punto final con el plásmidopBluescript como molde, utilizando oligonucleótidos biotiniladosen el extremo 5´. Se determinó un LD para los ensayos de IPCRdirecta y sandwich, de 1x10-3 µg/ml y 1x10-4 µg/ml respectivamente,representando una mejora en el LD de 1000 veces entre elELISA directo y la IPCR sandwich. En una segunda etapa, nuestroobjetivo particular es la detección cuantitativa de la hormona h-TSH en suero humano basado en ELISA e IPCR. Para ello, seseleccionaron 10 líneas productoras de mAbs anti-hTSH, realizándosela selección clonal de 4 de estas líneas por dilución límite.Se purificaron 8 mAbs específicos para las distintas subunidadesde h-TSH, los que luego se evaluaron en ensayos de ELISAde captura o sandwich logrando la detección de la hormona enconcentraciones séricas (0,5 ? 50 μUI/ml). Actualmente, estamosabocados a la optimización de las condiciones experimentales deuna IPCR apta para la detección de hTSH.