Clonado y expresión de una fracción antigénica del receptor de progesterona con alta homología interespecífica

MORENO PIOVANO G; RODRÍGUEZ HA; MONJE L; VARAYOUD J; MUÑOZ DE TORO M; LUQUE EH; RAMOS JG

Esperanza, Santa Fe. Argentina

Congreso; 5ta Reunión Argentina de Patología Veterinaria; 2006

La utilización de técnicas de inmunohistoquímica (IHQ) para la detección del receptor de progesterona (RP) es de extrema utilidad para el diagnóstico, tratamiento y pronóstico de numerosos tumores de origen mamario y endometrial. En patología clínica y experimental veterinarias este tipo de ensayos se realizan en biopsias de tejidos fijados en formaldehído e incluidos en parafina utilizando sistemas diseñados para su aplicación en medicina humana. Estas condiciones hacen que la sensibilidad y la especificidad de las reacciones antígeno-anticuerpo se vean comprometidas al momento de aplicarlas en tejidos animales, llevando a diagnósticos confusos con abundantes falsos positivos y negativos. Nuestro proyecto tiene como objetivo general producir un sistema de IHQ completo para la detección de RP en biopsias de origen humano y animal, para poder ser aplicado en salud humana y veterinaria. Como parte de ese proyecto, el objetivo de este trabajo fue clonar y expresar en E. coli una proteína de fusión antigénica que contenga una fracción del gen de RP de rata, altamente homóloga al de especies tales como vaca (Bos taurus), oveja (Ovis aries), perro (Canis familiaris), ratón (Mus musculus) y hombre (Homo sapiens). Para la determinación de las homologías entre las diferentes secuencias génicas se utilizó la herramienta bioinformática de dominio público BLAST 2.2.1.3. Para el cálculo de la antigenicidad teórica de secuencias polipeptídicas se utilizó el programa VECTOR NTI 6.0. Se purificó ARN total proveniente de útero de rata por el método del cloroformo-fenol-alcohol isoamílico. Se amplificó por RT-PCR la fracción del gen RP elegida y se diseñó una estrategia de clonado direccional usando el vector plasmídico pGEX 4T-3. Se insertó el fragmento amplificado en los sitios XhoI y EcoRI de tal manera de mantener el marco abierto de lectura con el gen del enzima glutatión-S-transferasa (GST) codificado por el vector. Se realizó la ligación utilizando T4-ADN ligasa y se obtuvo el constructo pGEXGST-PR que consiste en un gen de fusión que incluye la secuencia codificante de GST y el fragmento PR. Con este constructo se transformaron bacterias E. coli DH5a por el método del Cl2Ca. Las colonias transformantes fueron seleccionadas usando el antibiótico ampicilina y los clones recombinantes fueron identificados por PCR usando oligonucleótidos específicos para el fragmento PR. Se seleccionaron 9 clones recombinantes para la construcción pGEXGST-PR. Con los clones 1 y 3 se transformaron bacterias E. coli JM109, escalando el cultivo a 200 ml. Se indujo la expresión de la proteína recombinante GST-PR con el agregado de IPTG en una concentración final de 250 nM. La expresión de la proteína se evaluó cuantitativamente por espectroscopia UV y ensayos de ELISA indirecto. Los resultados de los estudios bioinformáticos revelaron que el dominio de transactivación A/B es la región del RP que menos homología posee con el resto de los genes de la familia de los receptores nucleares. Se utilizó un fragmento de este dominio que va desde el nucleótido 1557 al 1684 del ARNm de rata codificando un polipéptido que incluye los aa 520 a 557 de la secuencia proteica. En este polipéptido se encontraron 2 regiones altamente antigénicas con la secuencia PYLNYLRPDS y SLPQK respectivamente. Ambas regiones antigénicas resultaron 100% homólogas para los genes de RP de vaca, oveja, perro, ratón y humano. La inducción de la proteína usando caldo de cultivo TB resultó en una mayor densidad celular que la obtenida usando el medio LB. Se obtuvieron masas de proteína recombinante de 4 mg ± 0.4 cada 200 ml de cultivo en forma completamente soluble. La proteína recombinante fue purificada por cromatografía de afinidad usando columnas de glutatión sefarosa, obteniéndose grados de pureza superiores al 90%. El plegamiento correcto de la proteína fue evidenciado utilizando una metodología de ELISA indirecto, en el cual se usó un anticuerpo primario comercial que reconoce la presencia del epitope PYLNYLRP. La reactividad límite se obtuvo en pocillos sensibilizados con 19 ng de proteína recombinante. Estos resultados demuestran que la proteína GST-PR presenta características bioquímicas aptas para ser utilizada como inmunógeno en la obtención de anticuerpos con alta reactividad cruzada interespecífica.