Producción de anticuerpos policlonales interespecíficos contra receptor de progesterona

MORENO PIOVANO G; RODRÍGUEZ HA; MONJE L; VARAYOUD J; MUÑOZ DE TORO M; LUQUE EH; RAMOS JG

Esperanza, Santa Fe. Argentina

Congreso; 5ta Reunión Argentina de Patología Veterinaria; 2006

El uso veterinario de técnicas inmunohistoquimicas (IHQ) para la detección del receptor de progesterona (RP) desarrolladas inicialmente para medicina humana, presentan problemas de sensibilidad y especificidad trayendo aparejado la aparición de falsos positivos y falsos negativos. Nuestro proyecto tiene como objetivo general producir un sistema de IHQ completo para la detección de RP en biopsias de origen humano y animal. Como parte de ese proyecto, el objetivo de este trabajo fue la obtención de anticuerpos policlonales con alta reactividad cruzada entre distintas especies animales para la determinación por inmunohistoquímica del receptor de progesterona empleando como inmunógeno la proteína de fusión antigénica GST-PR. Dicha proteína contiene una fracción del gen de RP de rata, altamente homóloga al de especies de interés zootécnico tales como vaca (Bos taurus), oveja (Ovis aries), perro (Canis familiaris) y ratón (Mus musculus) y también con el gen de origen humano (Homo sapiens). Para la generación de los anticuerpos se procedió a la inoculación de dos conejos (A y B), con el antígeno GST-PR. Se tomó una muestra de sangre de la cual se obtuvo el título del suero basal y luego se inyectó en forma subcutánea 100 ul por sitio (3 sitios) de la preparación constituida por 300 ul del antígeno diluido en PBS (1 ug/ul) y 300 ul de adyuvante completo de Freund. Quince días después se realizó una nueva inoculación de la misma preparación antes descripta, pero esta vez utilizando adyuvante incompleto de Freund. Este procedimiento se repitió dos veces cada 15 días, finalizando el proceso de inoculación a los 60 días de la primera inoculación. En ese momento se extrajo de cada conejo una muestra de sangre que se incubó a 37º C para lograr la coagulación, luego de lo cual fueron centrifugadas a 2500 rpm durante 20 minutos. Para seguir la evolución del título de los anticuerpos se utilizaron ensayos de ELISA indirectos. Para esto se sensibilizaron placas de poliestireno de 96 pozos de fondo plano (Greiner), con 200 ng/pozo de GST-PR, diluido en 100 ul de buffer de sensibilización (carbonato/bicarbonato de sodio 50 mM, pH 9,6). Los lavados se realizaron con  PBS-Tween 20 y el bloqueo de los sitios de interacción inespecífica con PBS-leche 4%. Para obtener los títulos, los antisueros se diluyeron sucesivamente con buffer de ELISA (PBS-Leche+0,05% Tween 20) utilizando como sistema de revelado anticuerpos anti-inmunoglobulinas de conejo conjugados con la enzima peroxidasa y diluidos 1/1500 en el buffer ELISA. El cromógeno utilizado fue TMB (Zymed). Para purificar los anticuerpos específicos se realizó una cromatografía de afinidad para IgG específicas de 8 ml del antisuero mediante el uso de una columna HiTrap NHS-Sefarosa activada (Amersham) a la cual se le acopló 10 mg del antígeno GST-PR. A las fracciones de elución se las concentró utilizando tubos de filtración forzada (Centricon, límite de paso 30 KDa, Millipore). La elución de los anticuerpos se evaluó cuantitativamente por espectroscopia UV. El título alcanzado con el protocolo de inmunización fue de 1/256.000 en el conejo A y 1/128.000 en el conejo B. Para comprobar la especificidad de los anticuerpos obtenidos se realizaron ensayos de western blot a partir de homogenatos de proteínas nucleares provenientes de tejido uterino de rata. Se observó el desarrollo de 2 bandas de 93 y 116 Kda correspondientes a las isoformas A y B del RP. Para la evaluación de la reactividad del anticuerpo en IHQ, se realizaron ensayos indirectos utilizando muestras de tejido correspondientes a útero de rata y ratón, mama de oveja, ovarios de vaca y tumores mamarios humanos. Se ensayaron diluciones sucesivas desde 1/10 hasta 1/400 del anticuerpo primario anti-GST-PR y como anticuerpo secundario se utilizaron  anti-inmunoglobulinas de conejo (Zymed) diluídos 1/200 en PBS-Leche 1%. Como anticuerpo de referencia se utilizó el anti-PR de Dako A0098. El revelado se efectuó con diaminobencidina en Tris-HCl-H2O2.  Los ensayos de IHQ en útero de rata revelaron marcación nuclear específica de las celulas positivas hasta una dilución 1/200, obteniéndose el mismo resultado en muestras de úteros de ratón, mama de oveja y ovario de vaca. El anticuerpo mostró reactividad con tejido mamario humano aunque con niveles de tinción citoplasmática significativa (background). En muestras de rata no hubo diferencias estadísticamente significativas en el porcentaje de células positivas evaluadas con el anti-GST-PR y con el anticuerpo comercial de DAKO (p<0.01). Estos resultados demuestran que el anticuerpo anti-GST-PR presenta características inmunológicas y bioquímicas aptas para ser utilizado como anticuerpo primario en ensayos de IHQ en tejidos animales de interés zootécnico. Su alta especificidad y reactividad permiten aplicarlo en la exploración de patologías oncológicas y/o reproductivas en bovinos y ovinos.