Mecanismos de lipoilación proteica como nuevo blanco quimioterapéutico en bacterias Gram positivas

SCATTOLINI, A; MANSILLA, MC; PALLOTTA, M

Rosario

Jornada; XIV Jornadas de Ciencias, Tecnologías e Innovación de la UNR; 2020

UNR

Las infecciones provocadas por la bacteria Gram positiva Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (MRSA) constituyen un problema de salud global. La creciente aparición de cepas multi-resistentes plantea una demanda social de estrategias alternativas e imaginativas para el descubrimiento de nuevas drogas que controlen a los microorganismos a través de mecanismos no explotados hasta el momento. La interferencia de la vía de síntesis de ácido lipoico (AL), un cofactor organosulfurado requerido para el funcionamiento de complejos multienzimáticos involucrados en el metabolismo oxidativo y de un carbono, podría ser un potencial blanco quimioterapéutico contra MRSA. La bacteria modelo Gram positiva Bacillus subtilis requiere de tres enzimas para la síntesis del AL: la octanoiltransferasa (LipM) transfiere octanoilo desde ACP a GcvH, la lipoato sintasa incorpora los átomos de azufre produciendo lipoil-GcvH y por último, la amidotransferasa transfiere el residuo lipoilo a los restantes complejos enzimáticos. En nuestro laboratorio buscamos identificar, a través de una estrategia racional, compuestos antibacterianos que afecten la lipoilación de proteínas. Dado que la similitud de estructura primaria de SaLipM es muy baja con las de las octanoiltransferasas y ligasas cristalizadas, pero muy similar a la de B. subtilis, nos propusimos obtener cristales de la misma y determinar su estructura tridimensional. El gen BslipM se clonó bajo un promotor inducible por IPTG en el plásmido pMAL (New England Biolabs), que permite la expresión de proteínas de fusión a la proteína de unión a maltosa (MBP) en el extremo N-terminal. Se incorporó además la secuencia de corte con la proteasa TeV, que permite la posterior separación de MBP. El plásmido pMAL-BslipM se transformó en la cepa hospedadora DH5α. La proteína de fusión se expresó mediante el agregado de IPTG 0,3 mM durante dos horas a 37°C. La purificación se realizó por cromatografía de afinidad, utilizando una resina de amilosa y eluyendo con maltosa10 mM. La proteína de fusión de 83KDa se obtuvo mayoritariamente en el sobrenadante. Para separar LipM de MBP y de TeV-His se eluyó la mezcla en dos columnas consecutivas con resinas de amilosa y de Ni-Sepharose. La obtención de la estructura cristalina de LipM nos permitirá contar con un mejor sustrato para el diseño racional de inhibidores mediante docking molecular.