Protección del cultivo de soja frente al ataque de hongos fitopatógenos mediante cepas de Streptomyces

BÁRBARA A. BERCOVICH; MA. AMALIA CHIESA; DAVID L. VILLAFAÑE; EDUARDO RODRIGUEZ; HUGO GRAMAJO

Rosario

Congreso; Mercosoja; 2019

PROTECCIÓN DEL CULTIVO DE SOJA FRENTE AL ATAQUE DE HONGOS FITOPATÓGENOS MEDIANTE CEPAS DE STREPTOMYCES BA Bercovich1, DL Villafañe1, L Lario2, H Gramajo1, MA Chiesa3, E Rodriguez1*1Departamento de Microbiología, Facultad de Cs. Bioquímicas y Farmacéuticas, UNR - Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET), Ocampo y Esmeralda S/N, 2000 Rosario, Santa Fe, Argentina. 2Centro de Estudios Fotosintéticos y Bioquímicos (CEFOBI-CONICET), Suipacha 531, 2000 Rosario, Santa Fe, Argentina. 3Laboratorio de EcoFisiología Vegetal (LEFiVe) Facultad de Cs. Agrarias, UNR - Instituto de Investigaciones en Ciencias Agrarias de Rosario (IICAR-CONICET), Parque Villarino S/N, 2125 Zavalla, Santa Fe, Argentina. *erodriguez@ibr-conicet.gov.arPalabras clave: biocontrol, soja, Streptomyces.IntroducciónPara el 2050 se proyecta que, para cubrir la demanda global de alimentos, la producción agrícola mundial debería incrementarse en un 60-110 % (Blaser y col., 2016). Argentina es uno de los países con capacidad para satisfacer parte de esa demanda, siendo el tercer productor mundial de grano de soja [Glycine max (L.) Merrill]. La soja es el cultivo de mayor importancia económica en nuestro país, tanto por la superficie cultivada (17,3 millones ha en 2018/2019) como por los volúmenes producidos (56,5 millones tn) y exportados. No obstante, uno de los principales factores que afectan la producción de soja y causa de pérdidas económicas millonarias es el estrés biótico originado por distintos fitopatógenos (Hartman y col., 2011; Fisher y col., 2012). Entre los patógenos que más la afectan podemos destacar a Fusarium tucumaniae y Macrophomina phaseolina, ambos patógenos de suelo, causales del Síndrome de la Muerte Súbita (SMS), la Podredumbre Carbonosa (PC) de raíz, respectivamente. Actualmente, el cultivo de soja se protege contra las enfermedades de origen fúngico a través de la aplicación de fungicidas o curasemillas (químicos sintéticos), cuyo uso está cada vez más restringido y discutido, debido a los efectos nocivos para la salud humana y del medioambiente. Una alternativa sustentable y que ha mostrado ser efectiva en amplio número de especies vegetales, es el agregado de microorganismos del suelo, o los compuestos producidos por ellos, como agentes de control biológico para prevenir la infección de patógenos en plantas cultivadas. Hasta el presente, el desarrollo de microorganismos biocontroladores se ha limitado al género Trichoderma, Bacillus y Pseudomonas. Sin embargo, numerosos estudios recientes en distintos cultivos apuntan a la acción de biocontrol que ejercen las actinobacterias sobre los patógenos de plantas (Palaniyandi y col., 2013; Sathya et al, 2017; Vurukonda y Stefani, 2018). Las actinobacterias, principalmente el género Streptomyces, son bacterias Gram positivas del suelo productoras de más de la mitad de los productos naturales de uso terapéuticos incluyendo importantes antifúngicos. Consecuentemente, estas bacterias han sido ampliamente estudiadas y utilizadas por las industrias farmacológicas principalmente para la producción de antibióticos, antifúngicos y compuestos de uso terapéuticos. Las actinobacterias que están presente en la rizosfera, siendo algunas de ellas endofíticas, ejercen efectos de promoción del crecimiento vegetal de manera directa o indirecta mediante diversos mecanismos tales como producción de fitohormonas (IAA, ACC), producción de sideróforos, fijación de nitrógeno (género Frankia), solubilización del fosfato y producción de antifúngicos y exoenzimas como quitinasas (Vurukonda y Stefani, 2018). Sin embargo, hasta el presente existen pocos biocontroladores en el mercado formulados a partir de actinobacterias del género Streptomyces (Mycostop, Actinovate), en particular ninguno de estos se comercializa en nuestro país y aún no han sido desarrollados para su aplicación en cultivos como el de soja. Por lo tanto, el objetivo del presente trabajo es estudiar cepas de Streptomyces productoras de antifúngicos naturales que permitan la protección del cultivo de soja frente a distintos hongos fitopatógenos.Materiales y métodosMicroorganismos, reactivos y material vegetalEn este trabajo se utilizaron las siguientes cepas bacterianas: Streptomyces eurocidicus B-1676, S. filipinensis NRRL 2437 y Bradyrhizobium japonicum (NitroTotal®) aplicadas junto con un protector bacteriano (PROTEGE TS®). Las cepas de Streptomyces fueron crecidas para la obtención de micelios en medio líquido ISP2 a 30 °C con agitación y en el mismo medio con el agregado de agar para la obtención de esporas. Los fungicidas usados fueron: metalaxil, tiram y caberdazim. Los genotipos de soja usados fueron: DM 40R16 STS y DM 6.2I STS.Estudios de promoción del crecimientoLas semillas fueron recubiertas con las suspensiones bacterianas (con y sin el agregado de inoculante más protector bacteriano), y posteriormente fueron sembradas en macetas con tierra de campo y perlita (3:1). Inicialmente, las plantas fueron crecidas en vasos de 500cc, en un invernadero con un fotoperiodo artificial (16:8 hs luz:oscuridad) a 25°C durante 30 días. En este caso se evaluó: (a) el porcentaje de germinación de las semillas, (b) el peso, (c) la longitud de la raíz y (d) la longitud del tallo, medidos en cada planta a tiempo final (datos con los que se calculó el Índice de Vigor). Además, se determinó el patrón de nodulación: (e) Nº de nódulos en raíz principal y secundarias. En una segunda instancia, las plantas fueron crecidas en macetas de 5 L, en un invernadero con un fotoperiodo natural a 25°C durante cuatro meses. En este estudio se analizaron: (a) Nº nudos, ramificaciones y hojas y (b) altura de la planta. A cosecha, se registró el rendimiento: (c) Nº de vainas por planta, (d) Nº de semillas por vaina y (e) el rendimiento como el peso promedio de 10 semillas.Estudios de biocontrolEstos estudios se realizaron de manera similar a los anteriores con el agregado del patógeno según la interacción planta-patógeno analizada. Para el ensayo de biocontrol frente a la infección de F. tucumaniae CCC130-11, la inoculación con el patógeno se realizó por medio de granos de sorgo previamente infectados y cultivados durante 15 días a 25 ºC en oscuridad y agitación. A la mitad de las macetas se le adicionó una capa (7-10 g) de semillas de sorgo previamente infectadas, mientras que la otra mitad se mantuvo sin inocular (control). Posteriormente, fueron agregadas las semillas de soja con su tratamiento correspondiente, y las plantas se crecieron en un invernadero con un fotoperiodo artificial (16:8 hs luz:oscuridad) a 25°C por 25 d. El grado de infección se analizó según (a) la incidencia de la enfermedad (% de plantas con síntomas foliares) y (b) la severidad de la enfermedad según escala de gravedad de síntomas foliares (Rupe et al., 2001).Otro modelo utilizado fue el patosistema Soja-M. phaseolina. En este caso se utilizó el sistema in vitro previamente descripto con un aislamiento local caracterizado (Mp17) del patógeno (Reznikov y col., 2019). El ensayo se realizó en cámara de cultivo bajo condiciones controladas de luz y temperatura. Se siguió el progreso de los síntomas de la enfermedad según escala de necrosis del sistema radicular de cada planta.Resultados y conclusionesAnálisis del efecto antagónico de cepas StreptomycesEn este trabajo se analizaron dos cepas de Streptomyces productoras de antifúngicos de tipo polienos (eurocidina y filipina), S. eurocidius y S. filipinensis. Como primer paso se corroboró que las mismas presentaran actividad antifúngica en placa frente a hongos fitopatógenos de soja como F. tucumaniae y M. phaseolina, entre otros. Como control, se utilizaron cepas de Streptomyces mutantes no productoras de antifúngicos. Posteriormente, analizamos el posible efecto antagónico de estas cepas frente a Bradyrhizobium japonicum (bioinoculante) en comparación con el efecto observado por los antifúngicos comerciales. Esto se llevó a cabo a través de antibiogramas en placa y por recuento de B. japonicum viables obtenidas de semillas co-inoculadas con Streptomyces o antifúngicos. De esta manera se observó una alta toxicidad de los antifúngicos comerciales sobre Bradyrhizobium en contraposición al leve efecto que ejercen las cepas de Streptomyces sobre el inoculante (Fig. 1). Es de destacar que este efecto tóxico de los antifúngicos comerciales se propaga a toda la población de la rizosfera, afectando tanto a las comunidades de microorganismo fitopatógenos como también a los microorganismos beneficiosos para las plantas.Figura 1. Estudios de inhibición del crecimiento en placa. a) Efecto antagónico frente a hongos fitopatógenos de soja: F. tucumaniae (izq.) y F. verticilliodes (der.). Las cepas ensayadas fueron: S. eurocidicus B1676 (E), su mutante no productora (E.NF) y S. filipinensis (F). Cabe destacar que estos ensayos fueron realizados para los hongos patógenos M. phaseolina, D. phaseolorum, entre otros, observándose los mismos resultados. b) Efecto antagónico de antifúngicos comerciales y cepas de Streptomyces sobre B. japonicum. Estudio de las cepas de Streptomyces como promotores del crecimientoLuego, se ensayó el impacto de las cepas de Streptomyces sobre la planta, inoculando las semillas con éstas y analizando los parámetros de crecimiento previamente mencionados. Como se observa en la Fig. 2, ninguno de estos parámetros se vio significativamente afectado, sugiriendo que el agregado de dichas cepas no ejercía un efecto nocivo para el crecimiento y desarrollo normal de las plantas de soja.Figura 2. Estudios de la promoción del crecimiento con semillas inoculadas con S. eurocidicus (SE/E), S. filipinensis (SF/F) con y sin inocular (Control). Parámetros medidos: altura, cantidad de nódulos, número de hojas, nudos, ramificaciones, vainas, semillas y peso de las semillas.Análisis del efecto biocontrolador en diferentes modelos soja-fitopatógenosPor último, se analizó la capacidad de estas cepas para controlar los síntomas de SMS y PC en sistemas de infección controlada en invernaderos y cámara de cría. En este caso, además de los parámetros antes mencionados, se examinaron los niveles de incidencia y severidad en hojas y raíces según cada patosistema. Los resultados de estos estudios se muestran en las Fig. 3 (Soja-F. tucumaniae) y Fig. 4 (Soja-M. phaseolina). En ambos casos se puede observar una disminución significativa de los síntomas para ambas enfermedades comparado con plantas saludables de los controles sin tratar y con aquellas tratadas con los antifúngicos sintéticos. En estos ensayos también se analizaron cepas de Streptomyces no productoras de antifúngicos que mostraron efectos de protección similares a las parentales. De esta manera, podemos concluir que el género Streptomyces es adecuado para proteger a las plantas de soja de las infecciones contra hongos fitopatógenos sin afectar su crecimiento, ni al bioinoculante; convirtiéndose en una herramienta potencial, y de bajo impacto ambiental, para la protección del cultivo de la soja.Figura 3. Estudios de biocontrol sobre el patosistema Soja-F. tucumaniae. Figura 4. Estudios de biocontrol sobre el patosistema Soja-M. phaseolinaEstos resultados nos permiten proponer estudios a campo para ensayar estas nuevas formulaciones y analizar los efectos sobre el rendimiento y protección del cultivo. Para llevar a cabo esto, acorde a las legislaciones vigentes, iniciamos el aislamiento de actinobacterias autóctonas, principalmente del género Streptomyces, endofíticas y de la rizosfera utilizando plantas de soja de la zona núcleo (Santa Fe). Hasta el momento hemos logrado aislar más de 50 cepas que están siendo caracterizadas por nuestro grupo de trabajo.AgradecimientosAl Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y técnicas (CONICET). Ministerio de Ciencia, Tecnología e Innovación Productiva (MinCyT), Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT) PICT 2017-2421. BA Bercovich es Becaria CONICET. L Lario, H Gramajo, MA Chiesa y E Rodriguez son Investigadores de CONICET.Bibliografía Blaser y col.. (2016) mBIO 7(3):e00714-16.Fisher y col. (2012) Nature 484. Gregor y col. (2003) Can. J. Microbiol. 49: 483?491. Hartman y col. (2011) Food Sec. 3: 5.Kieser y col. (2000) Practical Streptomyces genetics 2000ed. John Innes Foundation, Norwich, United Kingdom.Newitt y col. (2019) Pathogens, 8: 78.Reznikov y col. (2019) Phytopathology, 109:63-73).Rupe y col. (2001) Can. J. Bot. 79: 829-835.Sathya y col. (2017) Biotech 7: 102. Stange and Scott (2005) Annu Rev Phytopathol. 43:83-116.Scandiani y col. (2010) PlantDis. 94: 1411-1416.Scandiani y col. (2015) J. Exp. Bot. 66(1): 391-402.Vasconcellos y col. (2010) ScientiaAgricola. 67(6): 743-746.Vurukonda y col. (2018) Int. J. Mol. Sci., 19: 952.